鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗檢測概述
鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗，即著名的Ames試驗，是國際上公認(rèn)且廣泛應(yīng)用的遺傳毒性初篩檢測方法。該試驗由Bruce Ames教授及其團(tuán)隊開發(fā)，其設(shè)計核心在于利用特定組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）突變株，在缺乏外源性組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。當(dāng)受試物具有致突變性時，可誘發(fā)這些菌株發(fā)生回復(fù)突變（回變），使其重新獲得合成組氨酸的能力（即變?yōu)閔is+），從而能夠在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上形成肉眼可見的回變菌落。哺乳動物微粒體酶（通常是經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的大鼠肝臟勻漿經(jīng)離心后得到的含細(xì)胞色素P450酶系的S9組分）的引入至關(guān)重要，它模擬了哺乳動物體內(nèi)的代謝活化過程，能夠?qū)⒛承┍旧頍o遺傳毒性但具有潛在遺傳毒性的前致突變物（procarcinogens）代謝活化為具有遺傳毒性的終致突變物（ultimate mutagens）。因此，Ames試驗在評估化學(xué)品、藥物、食品添加劑、化妝品原料及環(huán)境污染物等的潛在遺傳毒性和致癌風(fēng)險方面發(fā)揮著不可替代的作用。
檢測項目
Ames試驗的核心檢測項目是受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌特定菌株發(fā)生回變的致突變能力。具體檢測內(nèi)容包括：
- 受試物直接致突變性測試： 在不添加S9混合液（即無代謝活化系統(tǒng)）的條件下進(jìn)行，評估受試物本身是否具有致突變性。
- 受試物間接致突變性測試： 在添加S9混合液（即有代謝活化系統(tǒng)）的條件下進(jìn)行，評估受試物經(jīng)哺乳動物酶系統(tǒng)代謝活化后是否產(chǎn)生致突變性。
- 劑量-反應(yīng)關(guān)系測定： 通常至少測試5個濃度梯度，以觀察受試物致突變效應(yīng)是否隨濃度增加而增強(qiáng)，并確定是否具有統(tǒng)計學(xué)意義的陽性反應(yīng)。
- 菌株特異性測試： 常規(guī)使用一套標(biāo)準(zhǔn)菌株（如TA98, TA100, TA1535, TA1537, TA102等），它們具有不同的突變類型（移碼突變、堿基置換突變）和附加突變（如rfa突變使細(xì)胞壁通透性增加，uvrB突變使DNA切除修復(fù)能力缺失，pKM101質(zhì)粒增強(qiáng)錯誤傾向修復(fù)），以覆蓋廣泛的遺傳損傷類型。
檢測儀器
進(jìn)行Ames試驗需要一系列實驗室基礎(chǔ)儀器和設(shè)備，主要包括：
- 無菌操作設(shè)備： 生物安全柜或超凈工作臺（用于無菌操作）。
- 培養(yǎng)設(shè)備： 恒溫培養(yǎng)箱（通常設(shè)定37±1°C）、恒溫水浴鍋（用于融化頂層瓊脂和保溫）。
- 混合與混勻設(shè)備： 旋渦混合器（用于混勻菌液、S9混合液、受試物）。
- 樣品處理設(shè)備： 精密天平（稱量受試物）、離心機(jī)（制備S9組分）、pH計（調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和試劑的pH）。
- 滅菌設(shè)備： 高壓蒸汽滅菌鍋、干熱烘箱（用于培養(yǎng)基、器皿滅菌）。
- 稀釋與加樣設(shè)備： 微量移液器及其吸頭、稀釋瓶。
- 計數(shù)設(shè)備： 菌落計數(shù)器（手動或自動）、平板掃描儀（用于準(zhǔn)確計數(shù)菌落）。
- 配制設(shè)備： 磁力攪拌器（配制培養(yǎng)基）。
- 耗材： 培養(yǎng)皿（常用直徑90mm）、試管、三角瓶、量筒、燒杯等。
檢測方法
Ames試驗的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有兩種：平板摻入法和平皿預(yù)培養(yǎng)法。其中平板摻入法是最常用且被大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)引用的方法，其步驟如下：
- 菌株準(zhǔn)備： 將冷凍保存的特定菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期晚期（約10?~10? cells/mL）。
- S9混合液準(zhǔn)備（如需要）： 臨用前按配方配制S9混合液（含S9組分、NADP、G-6-P、鹽溶液等），并置于冰浴中。
- 頂層瓊脂準(zhǔn)備： 加熱融化頂層瓊脂（含微量組氨酸/生物素），并保溫在45°C水浴中。
- 加樣混合： 在無菌試管中依次加入：
- 0.1 mL 新鮮菌液
- 0.5 mL S9混合液（代謝活化組）或0.5 mL 緩沖鹽溶液（非代謝活化組）
- 0.1 mL 受試物溶液/溶劑對照（陰性對照）/陽性對照物溶液
立即旋渦混勻數(shù)秒。
- 鋪板：
- 將上述混合物迅速加入裝有約2 mL 45°C頂層瓊脂的試管中，快速混勻后立即傾倒于底層最低葡萄糖基本培養(yǎng)基平板（VBM）上，輕輕旋轉(zhuǎn)平板使頂層瓊脂均勻分布。
- 培養(yǎng)： 待頂層瓊脂凝固后，將平板倒置放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)48±2小時。
- 計數(shù)： 培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)每塊平板上的回變菌落數(shù)（his+菌落）。
平皿預(yù)培養(yǎng)法與平板摻入法類似，主要區(qū)別在于菌液、受試物和S9混合液（或緩沖液）先在較小體積中（如0.5-1mL）混合，在37°C振蕩培養(yǎng)20-30分鐘（預(yù)培養(yǎng)階段），然后再加入頂層瓊脂鋪板。
檢測標(biāo)準(zhǔn)
Ames試驗的操作、結(jié)果判定和質(zhì)量控制需嚴(yán)格遵循國際或國家認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)指南，以確保結(jié)果的可靠性和可比性。主要標(biāo)準(zhǔn)包括：
- OECD 測試指南 471： 《細(xì)菌回復(fù)突變試驗》。這是全球最廣泛采用的國際標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)規(guī)定了試驗原理、菌株要求、試驗設(shè)計（包括劑量選擇、重復(fù)數(shù)、對照設(shè)置）、操作步驟（平板摻入法和平皿預(yù)培養(yǎng)法）、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)。
- ISO 16240: 2005： 《水質(zhì) - 沙門氏菌/微粒體物質(zhì)試驗（Ames試驗）測定遺傳毒性》。主要針對水質(zhì)樣品的檢測。
- 中國國家標(biāo)準(zhǔn)：
- GB 15193.4-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗》：中國食品安全領(lǐng)域的強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。
- GB/T 21794-2008 《化學(xué)品 體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗方法》：雖然標(biāo)題是染色體畸變，但其中引用了Ames試驗作為遺傳毒性篩選方法，實際執(zhí)行通常遵循OECD 471原則。
- 新化學(xué)物質(zhì)申報等環(huán)節(jié)也常要求按照OECD 471進(jìn)行。
- ICH S2(R1)： 《人用藥物遺傳毒性試驗和結(jié)果分析指導(dǎo)原則》。該指導(dǎo)原則強(qiáng)烈推薦使用Ames試驗作為藥物遺傳毒性評價標(biāo)準(zhǔn)組合的一部分。
結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)OECD 471等）： 受試物在任何一個菌株、任何一個試驗條件下（無論有無S9），只要滿足以下條件之一，通常認(rèn)為具有致突變性（陽性）：
- 回變菌落數(shù)呈現(xiàn)劑量相關(guān)性增加（有統(tǒng)計學(xué)意義，如趨勢檢驗顯著）。
- 在任何一個劑量點，回變菌落數(shù)達(dá)到或超過溶劑對照（陰性對照）回變菌落數(shù)的2倍（對于TA1535, TA1537）或3倍（對于TA98, TA100, TA102等），且具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（如p<0.05）和可重復(fù)性（通常要求有明確劑量反應(yīng)關(guān)系或在至少兩個獨(dú)立試驗中重現(xiàn)）。
同時必須滿足陰性對照的回變菌落數(shù)在本實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，陽性對照的回變菌落數(shù)顯著增加。
CMA認(rèn)證
檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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