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口蹄疫病毒熒光RT－PCR檢測檢測

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發(fā)布時間：2025-05-14 03:57:05 更新時間：2025-05-13 03:57:06

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)概述

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是一種由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄類動物，具有傳播快、危害大的特點。因其對畜牧業(yè)的毀滅性影響，快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)對疫病防控至關(guān)重要。熒光RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）作為一種分子生物學(xué)檢測方法，憑借其高靈敏性、特異性和快速性，已成為口蹄疫病毒檢測的核心技術(shù)之一。該技術(shù)通過特異性引物和熒光探針，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒RNA的定性和定量分析，尤其在早期診斷和病毒分型中具有顯著優(yōu)勢。

檢測項目

口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測的主要目標(biāo)包括：1）檢測動物樣本（如口腔液、組織、血液）中是否存在口蹄疫病毒核酸；2）區(qū)分病毒血清型（如O型、A型、Asia1型）；3）評估病毒載量，為疫病風(fēng)險評估和防控策略提供依據(jù)。檢測范圍涵蓋臨床疑似病例、疫情監(jiān)測樣本及進(jìn)出口動物檢疫等場景。

檢測儀器

檢測所需的核心儀器包括：1）熒光定量PCR儀（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96），用于實時監(jiān)測擴(kuò)增信號；2）核酸提取儀（如Qiagen QIAcube），實現(xiàn)自動化RNA純化；3）高速離心機(jī)及微量移液器，用于樣本前處理；4）超凈工作臺和生物安全柜，保障實驗環(huán)境安全；5）-80℃超低溫冰箱，用于樣本和試劑的長期保存。

檢測方法

熒光RT-PCR檢測流程分為四個關(guān)鍵步驟：
1. 樣本處理：采集動物口腔上皮、水泡液或淋巴結(jié)組織，經(jīng)裂解液處理釋放病毒RNA；
2. RNA提?。菏褂么胖榉ɑ蛑椒ㄌ崛】俁NA，并通過核酸濃度檢測確保質(zhì)量；
3. 熒光RT-PCR反應(yīng)：配置含特異性引物、TaqMan探針、逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的混合體系，設(shè)置擴(kuò)增程序（通常為50℃ 15分鐘逆轉(zhuǎn)錄，95℃預(yù)變性后進(jìn)入40個循環(huán)的變性-退火-延伸）；
4. 結(jié)果分析：通過熒光閾值（Ct值）判定陽性樣本，同時設(shè)置陽性對照、陰性對照及內(nèi)參基因（如β-actin）驗證實驗有效性。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

檢測需嚴(yán)格遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：
1. OIE《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》：規(guī)定樣本處理、檢測流程和質(zhì)量控制要求；
2. 國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22915-2008《口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測方法》；
3. ISO/IEC 17025實驗室管理體系，確保檢測結(jié)果的可追溯性和準(zhǔn)確性；
4. 農(nóng)業(yè)部頒布的《口蹄疫防治技術(shù)規(guī)范》，明確檢測樣本類型、生物安全等級及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。實驗過程中需定期進(jìn)行試劑靈敏度驗證和實驗室間比對，以維持檢測系統(tǒng)的可靠性。