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副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-05-14 03:49:36 更新時(shí)間：2025-05-13 03:49:38

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)檢測(cè)

副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的重要性

副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, MAP）是引起反芻動(dòng)物副結(jié)核?。↗ohne's disease）的主要病原體，該病以慢性腸炎、進(jìn)行性消瘦和產(chǎn)奶量下降為特征，對(duì)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于MAP感染潛伏期長(zhǎng)且早期癥狀不明顯，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)方法靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足快速診斷需求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）因其高特異性、快速性和定量能力，已成為MAP檢測(cè)的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)、食品安全評(píng)估及環(huán)境樣本篩查等領(lǐng)域。

檢測(cè)項(xiàng)目與適用樣本類型

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)主要針對(duì)MAP的特異性基因序列（如IS900、ISMAP02或F57），檢測(cè)項(xiàng)目包括：

動(dòng)物組織樣本（腸系膜淋巴結(jié)、腸道黏膜）
糞便樣本（用于活菌檢測(cè)）
乳汁及乳制品（食品安全監(jiān)控）
環(huán)境樣本（養(yǎng)殖場(chǎng)水源、土壤）

檢測(cè)需關(guān)注樣本中MAP的DNA載量，并排除交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，尤其適用于隱性感染和早期感染的篩查。

核心檢測(cè)儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)需依賴以下關(guān)鍵儀器：

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：如ABI 7500、Bio-Rad CFX96等，支持TaqMan探針或SYBR Green檢測(cè)模式；
高速離心機(jī)：用于樣本DNA提取中的細(xì)胞裂解和雜質(zhì)分離；
核酸提取儀：自動(dòng)化提取MAP DNA，提高檢測(cè)一致性；
生物安全柜：確保核酸操作的無(wú)污染環(huán)境。

儀器需定期校準(zhǔn)并驗(yàn)證擴(kuò)增效率，確保檢測(cè)閾值（Ct值）的準(zhǔn)確性。

檢測(cè)方法與技術(shù)流程

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)MAP的標(biāo)準(zhǔn)流程包括：

樣本預(yù)處理：糞便樣本采用物理化學(xué)法富集細(xì)菌，組織樣本需勻漿并去除非特異性抑制劑；
DNA提取：使用商業(yè)化試劑盒（如QIAamp DNA Stool Mini Kit）提取靶標(biāo)DNA；
引物與探針設(shè)計(jì)：針對(duì)IS900基因設(shè)計(jì)特異性引物（如F:5'-ATGTCGCTGTGGTTCGATGC-3'，R:5'-CGTCGTCGTTGACGTCCATA-3'）及FAM標(biāo)記探針；
擴(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)體系含TaqMan Universal Master Mix，設(shè)置95℃預(yù)變性10分鐘，95℃ 15秒/60℃ 1分鐘的45個(gè)循環(huán)；
結(jié)果分析：根據(jù)Ct值和擴(kuò)增曲線判定陽(yáng)性，Ct≤35且曲線呈典型"S"型為陽(yáng)性。

實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板）和陽(yáng)性對(duì)照（已知濃度MAP DNA）以驗(yàn)證體系可靠性。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制

MAP實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)需遵循以下國(guó)際與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》中MAP檢測(cè)指南；
國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 35912-2018《動(dòng)物副結(jié)核病診斷技術(shù)》；
行業(yè)規(guī)范：SN/T 5364.7-2021《出口動(dòng)物疫病檢測(cè)規(guī)程第7部分：副結(jié)核分枝桿菌》。

質(zhì)量控制要求包括：

DNA提取效率驗(yàn)證（加入內(nèi)參基因如16S rRNA）；
檢測(cè)靈敏度≥10^2拷貝/反應(yīng)；
批內(nèi)與批間重復(fù)性變異系數(shù)（CV）≤5%；
交叉反應(yīng)測(cè)試：排除與結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌等的非特異性擴(kuò)增。

總結(jié)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為副結(jié)核分枝桿菌的精準(zhǔn)檢測(cè)提供了高效解決方案，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和嚴(yán)格的質(zhì)量控制，能夠?qū)崿F(xiàn)早期感染識(shí)別和傳播鏈追溯。未來(lái)隨著數(shù)字PCR等新技術(shù)的應(yīng)用，檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性將進(jìn)一步提升，為動(dòng)物疫病防控提供更強(qiáng)技術(shù)支撐。