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血清旁路途徑補(bǔ)體激活檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-10 09:26:00 更新時(shí)間：2025-08-09 09:26:00

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

血清旁路途徑補(bǔ)體激活檢測

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體先天免疫防御的關(guān)鍵組成部分，由一系列血漿蛋白構(gòu)成，通過級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮溶解病原體、調(diào)理吞噬、介導(dǎo)炎癥和清除免疫復(fù)合物等多種生物學(xué)功能。補(bǔ)體激活主要通過三條途徑實(shí)現(xiàn)：經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑。其中，旁路途徑（Alternative Pathway, AP）因其不依賴于特異性抗體或病原體相關(guān)分子模式（如甘露糖）的直接識別而獨(dú)樹一幟，它是機(jī)體早期、快速抵御微生物感染（尤其是革蘭氏陰性菌和某些病毒）的重要防線，并且在某些病理?xiàng)l件下（如自身免疫性疾病、C3腎小球?。┑难a(bǔ)體異常激活中扮演核心角色。因此，對血清中旁路途徑補(bǔ)體激活狀態(tài)的精確檢測，在臨床診斷（如評估免疫缺陷、監(jiān)測活動(dòng)性感染、診斷特定腎臟疾?。⒓膊C(jī)制研究及藥物研發(fā)（特別是補(bǔ)體靶向治療藥物的療效評估）中具有極其重要的意義。

檢測項(xiàng)目

血清旁路途徑補(bǔ)體激活檢測的核心目標(biāo)是評估旁路途徑的激活程度和功能完整性，主要涉及以下關(guān)鍵項(xiàng)目：

旁路途徑功能活性（AH50）檢測： 這是評估旁路途徑整體功能的核心試驗(yàn)。通過使用特定試劑（如兔紅細(xì)胞，其表面特性可選擇性激活旁路途徑）與待測血清孵育，檢測血清導(dǎo)致50%兔紅細(xì)胞溶血所需的血清量（AH50單位）。AH50降低提示旁路途徑功能缺陷。
旁路途徑激活產(chǎn)物檢測：
- C3轉(zhuǎn)化酶 (C3bBb) 或其片段： 旁路途徑的核心酶復(fù)合物或其穩(wěn)定形式（C3bBbP），是激活強(qiáng)度的直接指標(biāo)。
- Bb片段： 因子B被激活后裂解產(chǎn)生的片段，是旁路途徑激活的特異性標(biāo)志物。
- C3a、C5a： 強(qiáng)效的過敏毒素，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其水平升高反映補(bǔ)體級聯(lián)的激活（需注意這些片段也可由其他途徑產(chǎn)生）。
- C3d/g： C3的終末降解片段，具有較長的半衰期，是補(bǔ)體激活（包括旁路途徑）的穩(wěn)定標(biāo)志物。
- 可溶性C5b-9 (sC5b-9, 或末端補(bǔ)體復(fù)合物TCC)： 補(bǔ)體激活終末效應(yīng)的產(chǎn)物，反映膜攻擊復(fù)合物的形成。
旁路途徑調(diào)節(jié)因子檢測：
- 因子H (FH) 和因子I (FI)： 關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，其缺乏或功能異常極易導(dǎo)致旁路途徑過度激活（如非典型溶血尿毒綜合征 - aHUS）。
- 因子B (FB) 和因子D (FD)： 旁路途徑的正調(diào)控因子（限速酶）。
- 備解素 (Properdin, P)： 旁路途徑唯一的正性調(diào)節(jié)因子，穩(wěn)定C3轉(zhuǎn)化酶。
自身抗體檢測： 如抗因子H抗體、抗C3b抗體等，這些自身抗體可干擾旁路途徑的正常調(diào)控，導(dǎo)致疾病。

檢測儀器

旁路途徑補(bǔ)體激活檢測涉及多種技術(shù)平臺，常用的儀器包括：

酶標(biāo)儀 (Microplate Reader / ELISA Reader)： 用于基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或比色法（如AH50）的檢測，是測量補(bǔ)體蛋白濃度、激活片段（C3a, C5a, Bb, sC5b-9, C3d等）及調(diào)節(jié)因子水平的主力設(shè)備。
紫外/可見光分光光度計(jì) (Spectrophotometer)： 主要用于AH50溶血試驗(yàn)，通過測量特定波長（通常540nm）下的吸光度變化來定量溶血程度。
流式細(xì)胞儀 (Flow Cytometer)： 用于分析細(xì)胞表面補(bǔ)體活化產(chǎn)物（如C3b/iC3b/C3d沉積）、評估補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解，或進(jìn)行基于微球的免疫檢測（如檢測調(diào)節(jié)因子功能或自身抗體）。
化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 (Chemiluminescence Immunoassay Analyzer, CLIA)： 提供高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍的檢測，適用于部分補(bǔ)體片段（如C3a, C5a）和調(diào)節(jié)因子的定量。
多功能酶標(biāo)儀 (Multi-mode Microplate Reader)： 整合吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光等多種檢測模式，靈活性高。
自動(dòng)生化分析儀 (Automated Chemistry Analyzer)： 部分大型實(shí)驗(yàn)室用于運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)化的免疫比濁法檢測C3、C4等補(bǔ)體成分。
電泳/免疫固定電泳儀 (Electrophoresis / Immunofixation Electrophoresis)： 用于檢測與補(bǔ)體異常激活相關(guān)的單克隆免疫球蛋白（如C3腎炎因子 - C3NeF）。

檢測方法

根據(jù)檢測項(xiàng)目的不同，主要采用以下方法：

旁路途徑溶血活性試驗(yàn) (AH50)： 經(jīng)典的功能試驗(yàn)。將系列稀釋的待測血清與兔紅細(xì)胞（或雞/豚鼠紅細(xì)胞）在含EGTA（螯合Ca2?以阻斷經(jīng)典和凝集素途徑）和Mg2?（旁路途徑必需）的緩沖液中孵育。隨后離心，測定上清液在540nm處的吸光度，計(jì)算導(dǎo)致50%紅細(xì)胞溶血的血清稀釋度（AH50單位）。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)： 最廣泛應(yīng)用的方法。
- 夾心法ELISA： 用于定量檢測補(bǔ)體蛋白（如C3, FB, FH, FI, P）、激活片段（Bb, C3a, C5a, sC5b-9, C3d）濃度。使用針對目標(biāo)抗原不同表位的兩種特異性抗體（捕獲抗體和檢測抗體）。
- 捕獲法ELISA： 常用于檢測特定的酶復(fù)合物（如C3bBbP）。
- 競爭法ELISA： 可用于檢測小分子或半抗原。
免疫比濁法 (Immunoturbidimetry / Nephelometry)： 主要用于檢測血清中高豐度的補(bǔ)體蛋白（如C3, C4），自動(dòng)化程度高，速度快，但靈敏度通常低于ELISA，且不適用于片段檢測。
基于流式細(xì)胞術(shù)的檢測：
- 表面補(bǔ)體沉積分析：將特定靶細(xì)胞（如酵母多糖顆粒、包被特定物質(zhì)的微球或患者自身細(xì)胞）與血清孵育，用熒光標(biāo)記的抗體（如抗C3b, C3d, C5b-9）染色，通過流式檢測細(xì)胞表面補(bǔ)體活化產(chǎn)物的結(jié)合量。
- 基于微球的免疫檢測：將捕獲抗體偶聯(lián)到熒光微球上，與樣本孵育后再結(jié)合熒光二抗，通過流式分析微球上的熒光信號進(jìn)行定量。
- 調(diào)節(jié)因子功能/自身抗體檢測：利用特定包被的微球評估血清對補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)能力（如因子H功能）或檢測血清中存在的自身抗體（如抗FH抗體）。
C3腎炎因子 (C3NeF) 檢測：
- 交叉免疫電泳：可顯示C3轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定存在。
- ELISA：使用包被的C3bBb復(fù)合物檢測血清中能穩(wěn)定該復(fù)合物的C3NeF。
- 溶血試驗(yàn)：基于C3NeF能穩(wěn)定旁路途徑C3轉(zhuǎn)化酶的特性，通過改良的溶血體系進(jìn)行檢測。