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血漿游離血紅蛋白檢測

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發(fā)布時間：2025-08-04 03:50:23 更新時間：2025-08-03 03:50:23

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作者：中科光析科學技術研究所檢測中心

血漿游離血紅蛋白檢測：溶血性疾病診斷的關鍵指標

血漿游離血紅蛋白（Plasma Free Hemoglobin, PFH）是指在血漿中游離存在的、未與紅細胞膜結合的血紅蛋白。在正常情況下，成熟的紅細胞結構完整，血紅蛋白被嚴格包裹在紅細胞膜內(nèi)，血漿中僅存在極微量的游離血紅蛋白，通常低于50mg/L。然而，當發(fā)生血管內(nèi)溶血時，紅細胞在血管內(nèi)被破壞破裂，大量血紅蛋白釋放入血液循環(huán)，導致血漿游離血紅蛋白水平顯著升高。這種現(xiàn)象常見于多種病理狀態(tài)，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）、自身免疫性溶血性貧血（AIHA）、輸血反應、溶血性尿毒綜合征（HUS）、行軍性血紅蛋白尿、心臟機械瓣膜術后、嚴重燒傷、蛇毒咬傷、以及某些感染或藥物誘發(fā)等。持續(xù)升高的血漿游離血紅蛋白不僅本身是血管內(nèi)溶血的直接證據(jù)，其代謝產(chǎn)物（如高鐵血紅蛋白、血紅素、鐵離子）還可能對腎臟、血管內(nèi)皮等造成損傷，誘發(fā)急性腎損傷、凝血功能障礙等嚴重并發(fā)癥。因此，準確檢測血漿游離血紅蛋白水平對于溶血性疾病的早期診斷、病因鑒別、病情嚴重程度評估和治療效果監(jiān)測具有極其重要的臨床意義。

檢測項目：血漿游離血紅蛋白（PFH）

血漿游離血紅蛋白檢測是臨床實驗室診斷血管內(nèi)溶血的經(jīng)典且特異的項目之一。其主要臨床價值體現(xiàn)在：

診斷血管內(nèi)溶血： PFH升高是血管內(nèi)溶血最直接的生化標志。顯著升高強烈提示紅細胞在循環(huán)血液中被破壞。
評估溶血嚴重程度： PFH的水平高低通常與血管內(nèi)溶血的劇烈程度呈正相關。
鑒別診斷： 有助于區(qū)分血管內(nèi)溶血（PFH顯著升高）和血管外溶血（PFH升高不明顯，主要在脾臟等單核-巨噬細胞系統(tǒng)破壞）。
監(jiān)測輸血反應： 在輸血過程中或輸血后，PFH急劇升高是急性溶血性輸血反應的重要實驗室指標。
評估PNH等疾病活動度： 監(jiān)測PFH水平可幫助評估陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）等慢性血管內(nèi)溶血性疾病的病情活動情況。

檢測儀器

血漿游離血紅蛋白的定量檢測主要依賴以下兩類儀器：

分光光度計（Spectrophotometer）： 這是傳統(tǒng)且應用最廣泛的方法。其檢測原理基于血紅蛋白（特別是其衍生物）在特定波長下具有特征性的吸光度（光吸收峰）。血紅蛋白在415nm（Soret帶）和540-580nm區(qū)域有強吸收峰。
自動化生化分析儀（Automated Chemistry Analyzer）： 現(xiàn)代大型實驗室普遍使用全自動或半自動生化分析儀進行檢測。這些儀器通常基于分光光度法原理，自動化程度高，通量大，精密度好，并整合了樣本處理、試劑添加、反應孵育、吸光度測量和結果計算報告等功能。部分儀器還可能采用更先進的檢測模塊或方法學改進（如兩點法、多點法）。

檢測方法

目前臨床實驗室最常用的血漿游離血紅蛋白檢測方法是比色法（Colorimetric Method），特別是基于氰化高鐵血紅蛋白（Hemiglobincyanide, HiCN）法或其改良方法的雙波長比色法。其核心步驟和原理如下：

樣本采集與處理： 使用含有抗凝劑（如EDTA、肝素）的真空采血管采集靜脈血。采血過程必須輕柔、規(guī)范，避免體外溶血（這是干擾結果準確性的關鍵因素）。采集后應立即輕柔顛倒混勻，并在短時間內(nèi)（通常建議2-4小時內(nèi)，具體依據(jù)實驗室SOP）以高速度（如3000-4000 rpm）離心10-15分鐘，小心分離獲得無溶血跡象的血漿（淡黃色澄清）。如果血漿呈現(xiàn)紅色或粉紅色，提示可能存在顯著溶血（體內(nèi)或體外），需記錄并評估其對結果的影響。
試劑反應： 將處理好的血漿樣本與特定的堿性試劑（通常含有氰化鉀KCN或非氰化物替代品）混合。該試劑的作用是：
- 將血漿中所有形式的血紅蛋白（氧合Hb、脫氧Hb、高鐵Hb、少量碳氧Hb等）氧化并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）。
- HiCN在可見光區(qū)的540nm波長附近有一個非常穩(wěn)定且尖銳的最大吸收峰。
吸光度測定： 使用分光光度計或生化分析儀，在540nm（HiCN的最大吸收波長）處測定反應液的吸光度（A₅₄₀）。為了消除血漿樣本本身顏色（如黃疸、脂血）或濁度的干擾，通常采用雙波長法：
- 主波長（Primary Wavelength）：540nm - 這是HiCN的特征吸收峰。
- 次波長（Secondary Wavelength, Blanking Wavelength）：通常選用540nm附近的低吸收波長（如504nm、700nm或750nm等），該波長下HiCN和其他干擾物的吸光度較低或相近。
- 計算ΔA = A₅₄₀ - A_空白波長，此值主要反映HiCN的凈吸光度。
濃度計算： 根據(jù)朗伯-比爾定律（Lambert-Beer Law），溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度成正比。通過將測得的ΔA值代入標準曲線或使用已知的HiCN摩爾消光系數(shù)（ε_540nm = 11.0 L mmol?1 cm?1 或44.0 mL mg?1 cm?1，具體數(shù)值需確認試劑說明書或?qū)嶒炇襍OP）和光徑長度，即可計算出樣本中游離血紅蛋白的濃度（通常以mg/L或mg/dL報告）?，F(xiàn)代生化分析儀內(nèi)置軟件自動完成此計算。

關鍵注意事項：

嚴格防止體外溶血是保證結果準確性的首要前提。
試劑中的氰化物有劇毒，操作必須嚴格遵守安全規(guī)程，廢液需妥善處理（通常用次氯酸鈉溶液解毒）。
嚴重脂血、黃疸樣本可能干擾測定，需要評估或采用適當措施（如樣本空白、特殊處理方法）。

檢測標準與報告

參考區(qū)間（正常值）：
- 通常認為健康成人血漿游離血紅蛋白濃度應 < 50 mg/L (< 5 mg/dL)。
- 具體參考區(qū)間可能因檢測方法、儀器、試劑和人群略有差異，各實驗室應建立或驗證自己的參考范圍。
結果報告： 以數(shù)值形式報告檢測濃度，單位為mg/L（國際單位）或mg/dL（常用單位），需標明單位。同時，實驗室通常會在報告單上注明參考區(qū)間。
異常值分級（供臨床參考，非絕對標準）：
- 輕度升高：50 - 200 mg/L
- 中度升高：200 - 1000 mg/L
- 重度升高：> 1000 mg/L (嚴重血管內(nèi)溶血、急性溶血性輸血反應時可達數(shù)千甚至上萬mg/L)
質(zhì)量控制：
- 每次檢測均應使用配套的校準品進行校準。
- 每批次檢測應包含至少兩個水平（通常為正常水平和病理水平）的質(zhì)控品（Commercial Quality Control material），其測定值必須在預設的可接受范圍內(nèi)（如±2SD）。
- 參加室間質(zhì)評（EQA）/能力驗證（PT）計劃，評估實驗室間結果的一致性。
標準依據(jù)： 實驗室的操作應遵循相關的國家標準（如中國的WS/T系列標準）、行業(yè)指南（如臨床檢驗操作規(guī)程）、國際標準（如CLSI指南）以及試劑和儀器制造商提供的說明書。方法學通?；诠J的氰化高鐵血紅蛋白法原理。