細(xì)菌內(nèi)毒素/熱原檢測：守護(hù)藥品安全的生命線

細(xì)菌內(nèi)毒素（Bacterial Endotoxins， BET）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）成分，具有極強(qiáng)的致熱性和生物學(xué)活性。當(dāng)注射劑、生物制品、植入性醫(yī)療器械等醫(yī)療產(chǎn)品中存在超標(biāo)的細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)，一旦進(jìn)入人體血液循環(huán)，會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的發(fā)熱反應(yīng)（熱原反應(yīng)），嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克、多器官衰竭甚至死亡。因此，對(duì)藥品、醫(yī)療器械及相關(guān)物料進(jìn)行嚴(yán)格、準(zhǔn)確的細(xì)菌內(nèi)毒素/熱原檢測，是確保最終產(chǎn)品臨床使用安全、符合各國藥典和法規(guī)要求的強(qiáng)制性質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。這項(xiàng)檢測直接關(guān)系到患者的生命安危，是藥品生產(chǎn)領(lǐng)域質(zhì)量控制的“高壓線”和生命線。

檢測項(xiàng)目

細(xì)菌內(nèi)毒素/熱原檢測的核心目標(biāo)是定量或定性地確定樣品中內(nèi)毒素（LPS）的含量是否低于規(guī)定的安全限值。主要檢測項(xiàng)目包括：

1. 內(nèi)毒素限量（LAL）測定： 這是最常規(guī)的檢測項(xiàng)目，使用鱟試劑（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）測定樣品的內(nèi)毒素含量（通常以EU/mL或EU/mg表示），結(jié)果需低于藥典規(guī)定的該品種最大允許限值。
2. 熱原檢查（兔法）： 作為傳統(tǒng)方法或用于部分不適用LAL法的產(chǎn)品（如某些干擾物質(zhì)較多的樣品或醫(yī)療器械浸提液），通過注射樣品溶液到家兔體內(nèi)，觀察體溫變化來判斷是否存在致熱物質(zhì)。
3. 樣品干擾試驗(yàn)： 并非獨(dú)立項(xiàng)目，但至關(guān)重要。用于確認(rèn)樣品本身或其成分是否會(huì)對(duì)選定的LAL檢測方法產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。干擾試驗(yàn)通過驗(yàn)證方能進(jìn)行正式的內(nèi)毒素含量測定。

檢測儀器

現(xiàn)代細(xì)菌內(nèi)毒素檢測主要依靠基于鱟試劑（LAL）的檢測系統(tǒng)，所需的核心儀器包括：

1. 恒溫設(shè)備：

• 恒溫水浴槽/干式恒溫儀： 用于凝膠法（Gel-Clot）反應(yīng)管在特定溫度（通常37±1°C）下保溫孵育。
• 溫育/檢測一體機(jī)（如分光光度計(jì)配備溫育模塊）： 用于光度測定法（濁度法、顯色法）在恒溫條件下進(jìn)行反應(yīng)和實(shí)時(shí)監(jiān)測。

2. 光度測定設(shè)備：

• 動(dòng)態(tài)濁度法儀器： 連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)混合物濁度隨時(shí)間的增加速率，內(nèi)毒素濃度與達(dá)到預(yù)定吸光度閾值所需時(shí)間成反比。
• 終點(diǎn)濁度法儀器： 在反應(yīng)終止后測量最終濁度，內(nèi)毒素濃度與吸光度值成正比。
• 終點(diǎn)顯色法儀器： 在反應(yīng)終止并加入顯色劑/終止劑后，測量特定波長（如405nm或545nm）的吸光度變化，內(nèi)毒素濃度與顏色深淺（吸光度）成正比。

3. 其他輔助設(shè)備： 漩渦混合器、精密移液器（最好帶濾芯吸頭）、計(jì)時(shí)器、pH計(jì)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測專用實(shí)驗(yàn)室用具（如無熱原吸頭、試管、試劑溶解管）等。
4. 兔法熱原檢測專用設(shè)備： 家兔固定器、精確體溫測量設(shè)備（如電子體溫計(jì)）、注射設(shè)備等。

檢測方法

主要檢測方法分為兩大類：

1. 鱟試劑法（LAL Test） - 現(xiàn)行主流方法

• 凝膠法（Gel-Clot）： 最經(jīng)典的方法。將樣品與鱟試劑混合，在37°C水浴中孵育規(guī)定時(shí)間（通常60±2分鐘）。通過肉眼觀察或?qū)Ｓ迷O(shè)備判斷反應(yīng)管底部是否形成堅(jiān)硬凝膠。形成凝膠為陽性（內(nèi)毒素≥靈敏度λ），否則為陰性。通過系列稀釋（2倍梯度）可測定樣品的半定量內(nèi)毒素含量（終點(diǎn)稀釋法）。
• 光度測定法：
  • 動(dòng)態(tài)濁度法（Kinetic Turbidimetric Assay, KTA）： 實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)混合物濁度的增加速率。內(nèi)毒素濃度越高，達(dá)到預(yù)設(shè)吸光度增量所需時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間T）越短。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算濃度。
  • 終點(diǎn)濁度法（Endpoint Turbidimetric Assay）： 在反應(yīng)結(jié)束時(shí)測量濁度（吸光度），通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算濃度。
  • 終點(diǎn)顯色法（Endpoint Chromogenic Assay）： 鱟試劑中含有合成肽底物和顯色劑。內(nèi)毒素激活的凝血酶原酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)裂解底物釋放出顯色基團(tuán)（如pNA）。反應(yīng)終止后測量特定波長吸光度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算濃度。

光度法靈敏度高、定量精確、自動(dòng)化程度高，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。

2. 家兔熱原試驗(yàn)（Rabbit Pyrogen Test, RPT）

將規(guī)定劑量的樣品溶液靜脈注射入健康家兔體內(nèi)，在注射后規(guī)定時(shí)間內(nèi)（通常3小時(shí)）多次測量其體溫變化。根據(jù)體溫升高的幅度和持續(xù)時(shí)間，判定樣品是否符合熱原檢查規(guī)定。該方法是一種生物整體反應(yīng)，檢測范圍不僅限于內(nèi)毒素，還包括其他致熱物質(zhì)，但操作復(fù)雜、成本高、重現(xiàn)性相對(duì)較低且涉及動(dòng)物倫理。其應(yīng)用正逐漸被更靈敏、特異、快速的LAL法替代。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)菌內(nèi)毒素/熱原檢測遵循嚴(yán)格的國際和各國藥典標(biāo)準(zhǔn)，核心標(biāo)準(zhǔn)包括：

1. 中國藥典（ChP）：

• 通則 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：詳細(xì)規(guī)定了凝膠法、光度測定法的試驗(yàn)原理、試劑、儀器、操作步驟、結(jié)果判斷和有效性要求。
• 通則 1142 熱原檢查法：規(guī)定了家兔熱原試驗(yàn)的方法和要求。

2. 美國藥典（USP）：

• <85> Bacterial Endotoxins Test：詳細(xì)規(guī)范了凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法、顯色法（終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)）的操作、驗(yàn)證、計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)。
• <151> Pyrogen Test：規(guī)范了家兔熱原試驗(yàn)。

3. 歐洲藥典（EP）：

• Chapter 2.6.14. Bacterial Endotoxins：內(nèi)容涵蓋凝膠法和光度測定法。
• Chapter 2.6.8. Pyrogens：包含家兔熱原試驗(yàn)。

4. 日本藥典（JP）：

• General Test 4.01 Bacterial Endotoxins Test
• General Test 4.04 Pyrogen Test

5. 國際標(biāo)準(zhǔn)：

• ISO 10993-11: Biological evaluation of medical devices - Part 11: Tests for systemic toxicity：對(duì)醫(yī)療器械的急性全身毒性試驗(yàn)（包括熱原和內(nèi)毒素）提出了要求。
• ANSI/AAMI ST72:2019 Bacterial endotoxins - Test methodologies, routine monitoring, and alternatives to batch testing：針對(duì)醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢測提供了更具體的指南。

這些標(biāo)準(zhǔn)的核心要求是一致的：確保檢測方法的有效性（包括試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)驗(yàn)證）、操作的規(guī)范性以及結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，最終目標(biāo)是保障患者的用藥安全和生命健康。實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格遵循適用的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和管理。