脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾檢測：生物藥物質(zhì)量控制的基石
在生物制藥領(lǐng)域，尤其是蛋白質(zhì)治療藥物（如單克隆抗體、治療性蛋白）的開發(fā)與生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTMs）是決定其質(zhì)量、穩(wěn)定性、效價、安全性和免疫原性的關(guān)鍵因素。其中，脫酰胺化、氧化和糖譜/糖基化修飾是最具挑戰(zhàn)性且需要密切監(jiān)控的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）。脫酰胺化主要涉及天冬酰胺（Asn）殘基在特定條件下水解為天冬氨酸（Asp）或異天冬氨酸（isoAsp），導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷、構(gòu)象和功能改變；氧化則通常發(fā)生在甲硫氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）等含硫或芳香族氨基酸上，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并可能引發(fā)聚集或功能喪失；而糖基化修飾（尤其是N-連接糖基化）則極大地影響蛋白質(zhì)的藥代動力學(xué)、效應(yīng)子功能和免疫原性。對這些修飾進(jìn)行精準(zhǔn)、靈敏、可靠的檢測，貫穿于藥物發(fā)現(xiàn)、工藝開發(fā)、生產(chǎn)放行和穩(wěn)定性研究的全生命周期，是確保生物藥物安全有效、質(zhì)量可控的核心環(huán)節(jié)。
檢測項目
1. 脫酰胺化檢測：
* 總脫酰胺化水平： 整體評估蛋白質(zhì)中Asn轉(zhuǎn)化為Asp/isoAsp的比例。
* 位點特異性脫酰胺化： 精確定位并定量特定Asn位點（尤其是位于易變區(qū)如CDR區(qū)或柔性loop區(qū)的位點）的脫酰胺化程度。
* 異天冬氨酸（isoAsp）含量： 區(qū)分Asp和isoAsp，因為isoAsp的形成可能導(dǎo)致更顯著的結(jié)構(gòu)擾動和功能影響。
2. 氧化檢測：
* 總氧化水平： 評估整體Met、Trp、Cys等氨基酸的氧化程度。
* 位點特異性氧化： 確定并量化特定易氧化位點（如Fc區(qū)的Met252, Met428；CDR區(qū)的Trp）上的氧化修飾（如甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜；色氨酸氧化產(chǎn)物）。
* 不同氧化態(tài)的比例： 區(qū)分單氧化（亞砜）和雙氧化（砜）狀態(tài)。
3. 糖譜/糖基化修飾檢測：
* 總糖含量： 測定蛋白質(zhì)上連接的總糖量。
* 糖基化位點占據(jù)率： 評估潛在糖基化位點（如Asn-X-Ser/Thr）的實際糖基化比例。
* N-糖鏈分析： 鑒定和定量釋放的N-聚糖的結(jié)構(gòu)（如高甘露糖型、雜合型、復(fù)合型）、組成（甘露糖、半乳糖、巖藻糖、唾液酸等）、分支度、核心巖藻糖基化、末端半乳糖基化、唾液酸化程度及類型等。
* O-糖鏈分析（如適用）： 鑒定和定量O-連接糖鏈（通常更小且結(jié)構(gòu)更多樣化）。
* 糖型分布： 綜合報告不同糖型（Glycoform）的相對豐度。
檢測儀器
這些復(fù)雜修飾的分析高度依賴先進(jìn)的分離和檢測技術(shù)平臺：
1. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：
* LC-MS/MS (肽圖分析)： 這是進(jìn)行位點特異性脫酰胺化和氧化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。通過特異性酶解（如胰蛋白酶）將蛋白質(zhì)消化成肽段，利用高效液相色譜（HPLC/UHPLC）分離，再結(jié)合高分辨率質(zhì)譜（如Q-TOF, Orbitrap）進(jìn)行檢測與二級碎片分析（MS/MS）。通過比較修飾肽段與非修飾肽段的質(zhì)譜信號強度或峰面積進(jìn)行精確定量，并可區(qū)分Asp和isoAsp（通常基于酶解后的保留時間差異或在特定條件下的碎片離子差異）。對于氧化，則通過檢測特定肽段質(zhì)量增加（如Met+16Da, Trp+16/+32Da等）及MS/MS確認(rèn)來實現(xiàn)。
* LC-MS/MS (完整/亞基質(zhì)量分析)： 用于快速評估總脫酰胺化（分子量增加~1 Da）和總氧化水平（分子量成比例增加），以及復(fù)雜糖型分布（通過觀察完整蛋白或還原/非還原重輕鏈亞基的分子量異質(zhì)性）。
2. 毛細(xì)管電泳：
* CE-SDS (還原/非還原)： 主要用于分析純度、大小異質(zhì)性和聚合體，對電荷變體（如脫酰胺化引起的酸性峰）也有一定分離能力。
* cIEF (毛細(xì)管等電聚焦)： 是分離和定量電荷異質(zhì)體（包括脫酰胺化產(chǎn)物、唾液酸化程度差異）的主要方法。
3. 糖分析專用儀器：
* MALDI-TOF MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)： 常用于釋放后的N-聚糖和O-聚糖的指紋圖譜分析，提供糖鏈的整體輪廓和分子量信息，操作相對快速簡便。
* 親水相互作用色譜 (HILIC)： 通常與熒光檢測器（如FLD）或質(zhì)譜（HILIC-MS/MS）聯(lián)用，用于高靈敏度地分離和定量經(jīng)熒光標(biāo)記（如2-AB, 2-AA）的N-聚糖，提供詳細(xì)的糖鏈組成和結(jié)構(gòu)信息。
* 糖苷外切酶陣列： 結(jié)合HPLC/LC-MS/MS，用于糖鏈結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析。
* 凝集素芯片/凝集素親和層析： 利用不同凝集素對特定糖結(jié)構(gòu)的結(jié)合特異性，用于糖鏈的初步篩選或分組。
4. 其他輔助儀器： 酶標(biāo)儀（用于基于ELISA或凝集素親和的半定量檢測）、核磁共振（NMR，用于最精確的糖鏈結(jié)構(gòu)解析，但通量低、成本高）。
檢測方法
針對不同修飾，需要采用特定的樣品前處理和檢測策略：
1. 脫酰胺化檢測方法：
* 肽圖分析 (LC-MS/MS)： 蛋白質(zhì)經(jīng)變性、還原、烷基化、酶解（常用胰蛋白酶）后，通過RP-HPLC分離肽段，高分辨率質(zhì)譜檢測。通過提取修飾肽段離子流色譜圖（XIC）或使用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）/數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）尋找質(zhì)量增加0.984 Da（對應(yīng)脫酰胺化）的特征離子，MS/MS確定位點并定量。
* cIEF： 蛋白質(zhì)無需消化，直接通過等電聚焦分離，利用紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器分析主峰前后的酸性峰比例。
* 基于IsoQuant試劑盒或酶法 (PIMT)： 特異性檢測和定量isoAsp。
2. 氧化檢測方法：
* 肽圖分析 (LC-MS/MS)： 流程與脫酰胺化肽圖類似。關(guān)鍵點在于尋找質(zhì)量增加16 Da (Met亞砜, Trp羥基化等) 或32 Da (Met砜) 的肽段離子，MS/MS確認(rèn)氧化位點及修飾類型（區(qū)分Met和Trp氧化）。常在樣品處理中加入還原劑（如TCEP）作為對照，以區(qū)分工藝中引入的氧化和檢測過程中人為引入的氧化。
* 完整/亞基質(zhì)量分析 (LC-MS)： 直接分析完整蛋白或其還原后的重鏈、輕鏈，觀察分子量分布中對應(yīng)于氧化狀態(tài)增加的峰簇。
3. 糖譜/糖基化修飾檢測方法：
* N-糖鏈釋放與分析：
* 釋放： 使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）在變性條件下（通常含SDS和DTT/2-ME）將N-聚糖從蛋白質(zhì)骨架上完整釋放出來。釋放過程中會將連接的Asn轉(zhuǎn)化為Asp（分子量+1Da），這也是肽圖分析中鑒定糖基化位點的依據(jù)之一。
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CMA認(rèn)證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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