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表面微生物（接觸碟法）檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-01 19:07:56 更新時(shí)間：2025-07-31 19:07:56

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

表面微生物（接觸碟法）檢測(cè)

在制藥、醫(yī)療器械、食品生產(chǎn)、潔凈室環(huán)境控制以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域，對(duì)物體表面的微生物污染水平進(jìn)行有效監(jiān)控是確保產(chǎn)品質(zhì)量和操作安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。表面微生物檢測(cè)旨在評(píng)估清潔和消毒程序的效力，識(shí)別潛在的污染源，并驗(yàn)證生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況是否符合法規(guī)要求。在眾多表面采樣方法中，接觸碟法（Contact Plate Method）因其操作簡(jiǎn)便、定量性好、對(duì)表面損傷小等優(yōu)點(diǎn)，已成為快速評(píng)估規(guī)則、平整表面微生物污染的最常用技術(shù)之一。該方法的核心在于使用特制的、內(nèi)含固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（接觸碟），通過(guò)直接接觸采樣表面，將可能存在的微生物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，經(jīng)孵育后形成可見菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。

檢測(cè)項(xiàng)目

接觸碟法主要檢測(cè)項(xiàng)目通常包括：

需氧菌總數(shù)（Total Aerobic Microbial Count, TAMC）： 評(píng)估表面需氧微生物（包括細(xì)菌和酵母菌）的總體污染水平，是最基礎(chǔ)的微生物負(fù)荷指標(biāo)。
霉菌和酵母菌總數(shù)（Total Combined Yeasts and Molds Count, TYMC）： 在特定環(huán)境（如潮濕區(qū)域、或?qū)γ咕舾械膮^(qū)域）或產(chǎn)品需求時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
特定指示菌或致病菌（如適用）： 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或法規(guī)要求，可能需要對(duì)特定微生物（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌等）進(jìn)行篩查或定量。但這通常需要額外的增菌、分離和鑒定步驟。

檢測(cè)儀器與耗材

進(jìn)行接觸碟法檢測(cè)所需的核心儀器與耗材包括：

接觸碟（Contact Plates）： 特制的培養(yǎng)皿，通常直徑約55mm（如RODAC Plate - Replicate Organism Detection And Counting），內(nèi)裝約15-18ml的瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)基表面呈凸起的穹頂狀，確保與待測(cè)表面充分、均勻接觸。常用培養(yǎng)基有：
- 胰酪大豆胨瓊脂（Trypticase Soy Agar, TSA）： 用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。
- 沙氏葡萄糖瓊脂（Sabouraud Dextrose Agar, SDA）或馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）： 用于霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。
- （可選）含中和劑的培養(yǎng)基：如TSA或SDA中添加卵磷脂和聚山梨酯80（Lecithin and Polysorbate 80），用于中和采樣表面可能殘留的消毒劑。
恒溫培養(yǎng)箱（Incubators）：
- 用于培養(yǎng)需氧菌和酵母菌：通常設(shè)定在 30-35°C。
- 用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌：通常設(shè)定在 20-25°C。
菌落計(jì)數(shù)器（Colony Counter）： 輔助進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
無(wú)菌操作工具： 如無(wú)菌鑷子（用于操作接觸碟）、酒精棉球、記號(hào)筆等。
計(jì)時(shí)器： 確保接觸時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)化。

檢測(cè)方法

接觸碟法操作步驟如下：

準(zhǔn)備工作： 選擇符合檢測(cè)目的（TAMC或TYMC）和可能含中和劑的接觸碟。從冷藏環(huán)境中取出，平衡至室溫（避免冷凝水影響接觸和微生物復(fù)蘇）。在碟蓋上清晰標(biāo)記采樣點(diǎn)編號(hào)、日期等信息。
表面準(zhǔn)備： 確保待測(cè)表面已按正常程序清潔消毒，并達(dá)到規(guī)定的作用時(shí)間。采樣前表面應(yīng)干燥（除非方法驗(yàn)證接受潮濕表面）。
無(wú)菌操作： 操作人員佩戴無(wú)菌手套或使用無(wú)菌鑷子，小心打開接觸碟蓋，避免觸碰瓊脂表面或碟蓋內(nèi)側(cè)。
采樣操作： 迅速將瓊脂表面（凸面）平穩(wěn)、均勻地壓在待測(cè)表面上。施加適度且恒定的壓力（避免瓊脂破裂），保持接觸時(shí)間通常為 5-10 秒（需根據(jù)驗(yàn)證或標(biāo)準(zhǔn)操作程序SOP確定）。接觸過(guò)程中避免移動(dòng)或摩擦接觸碟。
取回與覆蓋： 平穩(wěn)、垂直地將接觸碟從表面提起，立即蓋上碟蓋。
培養(yǎng)：
- 用于TAMC的接觸碟（如TSA）：倒置置于30-35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3-5天（具體天數(shù)依據(jù)采納的標(biāo)準(zhǔn)，如藥典規(guī)定）。
- 用于TYMC的接觸碟（如SDA）：倒置置于20-25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5-7天（具體天數(shù)依據(jù)采納的標(biāo)準(zhǔn)）。
計(jì)數(shù)與報(bào)告： 培養(yǎng)結(jié)束后，立即計(jì)數(shù)瓊脂表面的菌落形成單位（CFU）。可使用菌落計(jì)數(shù)器輔助。報(bào)告結(jié)果通常為每個(gè)接觸碟的CFU數(shù)（CFU/plate）。對(duì)于蔓延菌落（spreader）的處理，需參照采用的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（如USP <61> 有具體指導(dǎo)）。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

表面微生物（接觸碟法）檢測(cè)的執(zhí)行與結(jié)果判定需遵循相關(guān)國(guó)家、國(guó)際或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)，常見標(biāo)準(zhǔn)包括：

ISO 18593:2018： 《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué) - 表面取樣的水平方法》 - 提供了包括接觸碟法在內(nèi)的多種表面微生物采樣方法的詳細(xì)指南。
中國(guó)藥典： 現(xiàn)行版藥典（如ChP 2020）的“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”指導(dǎo)原則以及“9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則”中，對(duì)潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測(cè)（常推薦接觸碟法）有明確要求，包括采樣點(diǎn)選擇、頻率、培養(yǎng)條件、結(jié)果計(jì)算和限度標(biāo)準(zhǔn)。不同潔凈級(jí)別（A/B, C, D）有不同的可接受限度（通常以CFU/碟或CFU/25cm2表示）。
美國(guó)藥典（USP）： USP <1116> “Microbiological Control and Monitoring of Aseptic Processing Environments” 詳細(xì)闡述了潔凈室環(huán)境（包括表面）的微生物監(jiān)測(cè)策略和方法，包括接觸碟的應(yīng)用和結(jié)果解讀。
歐盟 GMP 附錄 1： “無(wú)菌藥品生產(chǎn)” 最新版對(duì)潔凈室和隔離器的環(huán)境監(jiān)測(cè)提出了嚴(yán)格要求，包括表面微生物監(jiān)測(cè)（推薦接觸碟法），并規(guī)定了不同等級(jí)區(qū)域的行動(dòng)限和警戒限。
PIC/S 指南： 類似歐盟GMP要求。
行業(yè)特定標(biāo)準(zhǔn)： 醫(yī)療器械（如ISO 11737系列）、食品等行業(yè)也有相應(yīng)的表面微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

執(zhí)行檢測(cè)時(shí)，必須嚴(yán)格遵循所采納的標(biāo)準(zhǔn)和本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），并確保檢測(cè)環(huán)境（如潔凈度）和人員操作符合要求，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果需與既定的可接受標(biāo)準(zhǔn)（如警戒限Action Level和糾偏限Alert Level）進(jìn)行比較，超出標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需啟動(dòng)偏差調(diào)查及糾正預(yù)防措施（CAPA）。