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體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)-浸提液試驗(yàn)（MTT法）檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-01 16:13:41 更新時(shí)間：2025-07-31 16:13:42

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)-浸提液試驗(yàn)（MTT法）檢測

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種關(guān)鍵性的生物評(píng)價(jià)方法，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械、藥物、化妝品和生物材料的生物相容性評(píng)估中。它通過模擬人體內(nèi)環(huán)境，在體外培養(yǎng)細(xì)胞模型中檢測材料或其浸提液對(duì)細(xì)胞的影響，從而預(yù)測潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)試驗(yàn)的核心目的在于確保產(chǎn)品在臨床應(yīng)用前不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷，如抑制生長或?qū)е滤劳?。浸提液試?yàn)作為其中的一種重要變體，特別適用于評(píng)估固體或半固體材料釋放的可溶性成分的毒性：通過將材料在模擬體液（如生理鹽水或培養(yǎng)基）中浸提一定時(shí)間后，收集浸提液進(jìn)行測試，能高效地模擬材料在體內(nèi)的釋放行為。MTT法（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay）是檢測細(xì)胞毒性的常用方法，它基于MTT染料被活細(xì)胞的線粒體酶還原為藍(lán)色的甲臜晶體，通過測量吸光度變化來量化細(xì)胞活力。這種方法具有靈敏度高、操作簡便和結(jié)果客觀的優(yōu)點(diǎn)，已成為ISO和各國標(biāo)準(zhǔn)中推薦的黃金標(biāo)準(zhǔn)。隨著生物材料產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，MTT法的應(yīng)用日益廣泛，不僅能評(píng)估急性毒性，還能用于長期暴露研究，為產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

檢測項(xiàng)目

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)-浸提液試驗(yàn)的檢測項(xiàng)目主要聚焦于評(píng)估材料浸提液對(duì)細(xì)胞的影響，具體包括細(xì)胞活力、增殖抑制和毒性水平。核心檢測項(xiàng)目涉及細(xì)胞毒性指數(shù)（如IC50值）、細(xì)胞存活率和代謝活性變化。通過MTT法，可以量化浸提液導(dǎo)致的細(xì)胞死亡或生長抑制程度，例如測量細(xì)胞對(duì)MTT染料的還原能力，從而計(jì)算毒性百分比。這些項(xiàng)目幫助識(shí)別材料中的有害成分，如重金屬或有機(jī)化合物，確保其符合生物安全性要求。

檢測儀器

進(jìn)行MTT法檢測所需的儀器包括多種實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，以確保實(shí)驗(yàn)的精確性和可重復(fù)性。主要檢測儀器包括：微孔板閱讀器（如酶標(biāo)儀），用于測量甲臜晶體的吸光度（通常在570nm波長）；CO2培養(yǎng)箱，維持細(xì)胞培養(yǎng)的恒定環(huán)境（溫度37°C，濕度95%，CO2濃度5%）；恒溫水浴鍋或振蕩器，用于溶解甲臜晶體；倒置顯微鏡，用于細(xì)胞形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)；以及離心機(jī)和移液器等輔助設(shè)備。這些儀器協(xié)同工作，確保浸提液制備和MTT反應(yīng)過程的標(biāo)準(zhǔn)化。

檢測方法

MTT法檢測的具體方法包括幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)步驟：首先，細(xì)胞準(zhǔn)備階段，選用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（如L929或HepG2）接種于96孔板，培養(yǎng)至80%匯合度；其次，浸提液制備階段，將測試材料在37°C下浸提于培養(yǎng)基中24-72小時(shí)；接著，暴露階段，向細(xì)胞孔添加不同濃度的浸提液，孵育24-48小時(shí)；然后，MTT染色階段，加入MTT溶液（終濃度為0.5mg/mL），孵育4小時(shí)后形成甲臜晶體；最后，溶解和測量階段，移除培養(yǎng)基，加入溶解劑（如DMSO），振蕩溶解晶體，用酶標(biāo)儀讀取570nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。整個(gè)操作需在無菌條件下進(jìn)行，并以陰性對(duì)照（如培養(yǎng)基）和陽性對(duì)照（如苯酚溶液）驗(yàn)證結(jié)果可靠性。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

檢測標(biāo)準(zhǔn)是確保試驗(yàn)結(jié)果可比性和可靠性的關(guān)鍵，主要遵循國際和國內(nèi)規(guī)范。核心標(biāo)準(zhǔn)包括ISO 10993-5（醫(yī)療器械的生物評(píng)價(jià)-第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)），該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了浸提液制備、細(xì)胞選擇、MTT法的具體操作和結(jié)果判定準(zhǔn)則（如細(xì)胞存活率≥70%為無毒性）。此外，各國標(biāo)準(zhǔn)如中國GB/T 16886.5、美國藥典USP <87>和歐盟EN ISO 10993-5也提供類似指導(dǎo)。這些標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制，包括空白對(duì)照、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（如t檢驗(yàn)），以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和一致性。