體外細(xì)胞毒性試驗-直接接觸試驗檢測

體外細(xì)胞毒性試驗是評價醫(yī)療器械、生物材料、藥品及其成分潛在生物相容性的關(guān)鍵手段之一，其中直接接觸試驗是應(yīng)用最為廣泛且重要的方法。該試驗?zāi)M材料或器械在臨床使用中與其直接接觸的細(xì)胞或組織可能發(fā)生的相互作用，通過將待測樣品直接置于培養(yǎng)的細(xì)胞單層上，評估其對細(xì)胞形態(tài)、增殖、代謝活性等的影響，從而預(yù)測其潛在的體內(nèi)毒性風(fēng)險。直接接觸試驗因其直觀性和相對較高的敏感性，尤其適用于評估表面接觸的醫(yī)療器械（如植入物、導(dǎo)管、敷料）以及與細(xì)胞緊密接觸的材料。

檢測項目

直接接觸試驗的核心檢測項目圍繞細(xì)胞對直接接觸材料的反應(yīng)展開，主要包括：

1. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察： 在顯微鏡下（通常為倒置光學(xué)顯微鏡）直接觀察與樣品接觸后細(xì)胞的形態(tài)變化，如細(xì)胞圓縮、皺縮、裂解、空泡化、顆?；?、脫落等異常的細(xì)胞毒性反應(yīng)。
2. 細(xì)胞活性定量檢測： 利用特定的染色方法或生物化學(xué)試劑，定量測定接觸樣品后活細(xì)胞的數(shù)量或比例，以及細(xì)胞代謝活性的變化。最常用的方法是MTT/XTT/WST-1比色法（檢測線粒體脫氫酶活性）或中性紅攝取法（檢測溶酶體活性）。
3. 細(xì)胞增殖抑制率： 通過比較接觸組與對照組細(xì)胞的增殖情況（如通過細(xì)胞計數(shù)或DNA含量測定），計算樣品對細(xì)胞增殖的抑制程度。
4. 細(xì)胞死亡模式分析（可選）： 可通過流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V/PI雙染等方法，初步區(qū)分細(xì)胞凋亡與壞死。

檢測儀器

進(jìn)行體外細(xì)胞毒性直接接觸試驗需要以下主要儀器設(shè)備：

1. 超凈工作臺/生物安全柜： 提供無菌操作環(huán)境。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)箱： 維持恒定的溫度（37°C）、濕度（>90%）和二氧化碳濃度（通常5% CO2）。
3. 倒置光學(xué)顯微鏡： 用于觀察細(xì)胞形態(tài)和樣品接觸情況。
4. 酶標(biāo)儀： 用于讀取比色法（MTT/XTT/WST-1/中性紅等）的吸光度值（OD值），定量細(xì)胞活性。
5. 離心機(jī)： 用于細(xì)胞懸液的制備。
6. 移液器： 精確移取液體。
7. 細(xì)胞培養(yǎng)耗材： 如培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板（最常用96孔板）、離心管、移液管等。
8. 天平： 用于精確稱量樣品（如薄膜、顆粒等）。
9. 流式細(xì)胞儀（可選）： 用于進(jìn)行更深入的細(xì)胞死亡分析。

檢測方法

典型的直接接觸試驗操作流程如下：

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備： 選擇適當(dāng)?shù)牟溉閯游锛?xì)胞系（如L929小鼠成纖維細(xì)胞、V79中國倉鼠肺細(xì)胞、人源細(xì)胞等），在含血清培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、計數(shù)，以適宜的密度（通常使次日形成約80-90%融合度的單層細(xì)胞）接種于多孔培養(yǎng)板（如96孔板）中，置于培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)使其貼壁。
2. 樣品處理與放置： 將待測樣品（固體材料需滅菌，并切割/制備成適合放置在孔內(nèi)且不漂浮的尺寸，如薄膜、小片、顆粒；液體產(chǎn)品或浸提液直接滴加）小心地直接放置在孔內(nèi)已貼壁的細(xì)胞單層中央。確保樣品與細(xì)胞層充分接觸但避免劃傷細(xì)胞。設(shè)置空白對照組（僅含培養(yǎng)基和細(xì)胞）、陰性對照組（已知無毒材料，如高密度聚乙烯、特氟隆膜）和陽性對照組（已知有毒物質(zhì)，如含鋅有機(jī)化合物、乳膠）。
3. 共培養(yǎng)： 將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（通常為24小時或48小時）。
4. 顯微鏡觀察（形態(tài)學(xué)評價）： 共培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡下直接觀察各孔中細(xì)胞形態(tài)的變化，特別是緊鄰樣品邊緣及下方的細(xì)胞，按預(yù)先設(shè)定的評分標(biāo)準(zhǔn)（如0級：無細(xì)胞毒性；1級：輕微反應(yīng)；2級：中等反應(yīng)；3級：重度反應(yīng)；4級：完全破壞）進(jìn)行定性或半定量評價。
5. 細(xì)胞活性定量檢測：

• MTT法： 小心移除培養(yǎng)液（注意避免擾動樣品和細(xì)胞），每孔加入含MTT（四甲基偶氮唑鹽）的無血清培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)孵育數(shù)小時（如2-4小時）。棄去MTT溶液，每孔加入有機(jī)溶劑（如DMSO、異丙醇）溶解細(xì)胞內(nèi)生成的藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在特定波長（如570nm，參考波長630nm）下測定吸光度值（OD值）。
• 中性紅法： 移除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入含中性紅的培養(yǎng)液，孵育數(shù)小時（如2-3小時）?？焖傧礈烊コ磾z入的中性紅，加入細(xì)胞固定劑（如福爾馬林/乙醇混合液）固定細(xì)胞，再加入脫色劑（如含醋酸的乙醇溶液）溶解細(xì)胞內(nèi)攝入的中性紅。用酶標(biāo)儀在特定波長（如540nm）下測定吸光度值。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

體外細(xì)胞毒性試驗，特別是直接接觸法，主要遵循以下國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：

1. ISO 10993-5: Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
這是醫(yī)療器械生物相容性評價的核心國際標(biāo)準(zhǔn)之一。該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了體外細(xì)胞毒性試驗的通用要求、試驗方法（包括浸提液試驗和直接接觸試驗）、細(xì)胞系選擇、試驗步驟、結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)（推薦基于細(xì)胞活性降低的評價體系）等。它明確指出，對樣品進(jìn)行直接接觸試驗是評估其潛在局部細(xì)胞毒性的有效方法。通常認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞存活率≥70%時（相對于陰性對照），反應(yīng)不大于“輕微”（Grade 1），認(rèn)為樣品無潛在細(xì)胞毒性風(fēng)險；細(xì)胞存活率在50%-70%之間為“輕微反應(yīng)”（Grade 2）；低于50%則毒性反應(yīng)顯著增強(qiáng)（Grade 3或4）。
2. GB/T 16886.5-2017： 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗
這是中國國家標(biāo)準(zhǔn)，等同采用ISO 10993-5。其內(nèi)容與ISO 10993-5完全一致，是國內(nèi)進(jìn)行醫(yī)療器械體外細(xì)胞毒性評價（包括直接接觸試驗）的強(qiáng)制性依據(jù)。
3. USP <87> Biological Reactivity Tests, In Vitro
美國藥典通則<87>也提供了體外細(xì)胞毒性試驗的指導(dǎo)，包括直接接觸試驗（瓊脂擴(kuò)散法或直接接觸法）。其評價標(biāo)準(zhǔn)與ISO 10993-5類似，但具體的細(xì)胞系和瓊脂擴(kuò)散法有特定要求。

遵循這些標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行體外細(xì)胞毒性直接接觸試驗，能夠為醫(yī)療器械和生物材料的安全性評價提供重要且可靠的科學(xué)依據(jù)。值得注意的是，該試驗結(jié)果需要結(jié)合其他生物學(xué)評價試驗（如刺激與致敏、全身毒性、植入試驗等）以及產(chǎn)品預(yù)期用途進(jìn)行綜合風(fēng)險評估。

檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)證書

CMA認(rèn)證

檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書

證書編號：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS認(rèn)可

實驗室認(rèn)可證書

證書編號：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO認(rèn)證

質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書

證書編號：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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