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品系特異性序列檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-27 08:40:06 更新時(shí)間：2025-07-26 08:40:06

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

品系特異性序列檢測概述

品系特異性序列檢測（Strain-Specific Sequence Detection）是一項(xiàng)關(guān)鍵的分子生物學(xué)技術(shù)，主要用于鑒定和區(qū)分生物體（如微生物、植物、動物）中不同亞種、品系或克隆之間的細(xì)微遺傳差異。其核心在于識別和檢測目標(biāo)品系基因組中獨(dú)有的、高度特異的DNA或RNA序列標(biāo)記。這些標(biāo)記可能是單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/缺失（InDel）、簡單序列重復(fù)（SSR/微衛(wèi)星）、或者特定的基因序列變異。這項(xiàng)技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值，例如：

農(nóng)業(yè)與育種： 精確鑒定作物或家畜的優(yōu)良品系，確保種子/種苗純度，進(jìn)行品種權(quán)保護(hù)與真?zhèn)舞b別。
微生物學(xué)與醫(yī)學(xué)： 區(qū)分病原微生物的不同致病型、耐藥型或流行株系，用于疾病診斷、流行病學(xué)追蹤和防控。
生物安全與法規(guī)： 檢測和監(jiān)控轉(zhuǎn)基因生物（GMO）的特定品系或事件，確保符合法規(guī)要求。
法醫(yī)學(xué)： 進(jìn)行微生物或生物材料的溯源分析。
基礎(chǔ)研究： 研究種群遺傳結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和基因功能。

該技術(shù)的成功實(shí)施高度依賴于對目標(biāo)品系特有遺傳特征的深入了解、高靈敏度和高特異性的檢測方法以及嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

檢測項(xiàng)目

品系特異性序列檢測的核心檢測項(xiàng)目就是目標(biāo)品系特有的DNA或RNA序列本身。具體形式包括：

單核苷酸多態(tài)性 (SNP): 最具代表性的品系特異性標(biāo)記，指基因組中單個(gè)堿基位點(diǎn)的變異。檢測特定的SNP位點(diǎn)是區(qū)分品系最常用、最精確的手段之一。
插入/缺失 (InDel)： 指基因組中特定位置存在或缺失一小段序列（通常幾個(gè)到幾十個(gè)堿基）。這種長度差異易于檢測。
簡單序列重復(fù) (SSR) / 微衛(wèi)星 (Microsatellite)： 指由1-6個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，不同品系間重復(fù)次數(shù)存在差異。其多態(tài)性高，是傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記。
序列標(biāo)簽位點(diǎn) (STS)： 基因組中一段已知序列和位置的短DNA片段（通常200-500 bp），其序列在不同品系間存在特異性差異。
特定基因或等位基因變異： 檢測與特定性狀（如抗病性、品質(zhì)、代謝能力）或品系身份直接相關(guān)的功能基因或其特定等位基因型。
品系特異性分子條形碼： 人工設(shè)計(jì)或篩選的短DNA序列，作為該品系的唯一“身份編碼”。

檢測儀器

品系特異性序列檢測涉及多種精密儀器，根據(jù)所選方法的不同而有所側(cè)重：

PCR 儀 (熱循環(huán)儀)： 幾乎所有基于PCR的方法（常規(guī)PCR、qPCR, HRM, ARMS-PCR, CAPS/dCAPS等）的基礎(chǔ)設(shè)備，用于DNA/RNA的擴(kuò)增。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (qPCR儀)： 用于TaqMan探針法、SYBR Green I染料法、HRM等檢測SNP和特定序列，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測，具有高靈敏度和定量能力。
核酸電泳系統(tǒng)： 包括電源、電泳槽和成像系統(tǒng)（凝膠成像儀或紫外透射儀），用于瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物，通過條帶大小判斷結(jié)果（如SSR, CAPS/dCAPS）。
毛細(xì)管電泳儀 (CE)： 主要用于高分辨率、自動化的SSR/微衛(wèi)星分析，也可用于部分基于片段長度分析的SNP檢測方法。
DNA測序儀：
- Sanger測序儀： 金標(biāo)準(zhǔn)，用于直接測定目標(biāo)片段的堿基序列，確認(rèn)SNP、InDel等變異，驗(yàn)證其他方法結(jié)果。
- 高通量測序儀 (NGS)： 如Illumina, Ion Torrent, MGI等平臺，可同時(shí)對大量樣本、多個(gè)目標(biāo)區(qū)域甚至全基因組進(jìn)行測序，用于大規(guī)模品系鑒定、發(fā)現(xiàn)新標(biāo)記和深度分析。適用于復(fù)雜樣本或未知品系鑒定。
芯片掃描儀/分析儀： 當(dāng)使用基因芯片（如SNP芯片）進(jìn)行高通量SNP分型時(shí)，需要專用的芯片掃描設(shè)備讀取雜交信號。
數(shù)字PCR儀 (dPCR)： 提供絕對定量能力，在檢測痕量樣品或區(qū)分拷貝數(shù)變異時(shí)具有優(yōu)勢。
核酸提取純化系統(tǒng)： 自動化設(shè)備，用于高效、標(biāo)準(zhǔn)化地從樣本中提取高質(zhì)量的DNA/RNA，是檢測準(zhǔn)確性的前提。
分光光度計(jì)/熒光計(jì)： 用于測定核酸濃度和純度。

檢測方法

品系特異性序列檢測方法多樣，選擇取決于目標(biāo)標(biāo)記類型、通量需求、成本預(yù)算和所需精度：

基于PCR的方法：
- 等位基因特異性PCR (AS-PCR) / 擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR (ARMS-PCR)： 設(shè)計(jì)特異性引物，其3'端堿基與目標(biāo)SNP完全匹配才能有效擴(kuò)增，通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物判斷基因型。
- TaqMan探針法： 利用與SNP位點(diǎn)特異性結(jié)合的熒光探針（含報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)），在qPCR過程中通過檢測熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行SNP分型。最常用、通量較高。
- 高分辨率熔解曲線分析 (HRM)： 利用飽和染料監(jiān)測PCR產(chǎn)物熔解過程中熒光值的變化，不同SNP或微小序列差異導(dǎo)致熔解曲線形狀不同，無需探針，成本較低。
- CAPS/dCAPS (酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列/衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列)： PCR擴(kuò)增包含SNP/InDel的片段，利用限制性內(nèi)切酶（或通過引物設(shè)計(jì)創(chuàng)造酶切位點(diǎn)）進(jìn)行酶切，通過電泳分析條帶模式分型。
基于測序的方法：
- Sanger測序： 直接、準(zhǔn)確獲取目標(biāo)區(qū)域的堿基序列，是確認(rèn)變異和未知序列的金標(biāo)準(zhǔn)，但通量較低。
- 靶向測序 (Panel Sequencing)： 利用多重PCR或探針捕獲技術(shù)富集多個(gè)目標(biāo)區(qū)域，然后進(jìn)行NGS測序。適用于已知目標(biāo)位點(diǎn)的高通量、多位點(diǎn)檢測。
- 簡化基因組測序 (如RAD-seq, GBS)： 降低基因組復(fù)雜度后進(jìn)行NGS測序，用于大規(guī)模SNP開發(fā)和群體遺傳分析。
- 全基因組測序 (WGS)： 最全面的方法，可發(fā)現(xiàn)所有類型的變異，包括未知的品系特異性標(biāo)記，成本較高但信息量最大。
基于雜交的方法：
- 基因芯片 (Microarray)： 尤其是SNP芯片，通過核酸雜交原理，將待測樣本與固定在芯片上的大量探針雜交，檢測熒光信號進(jìn)行高通量SNP分型。
基于片段長度的方法：
- 微衛(wèi)星/SSR分析： PCR擴(kuò)增含SSR位點(diǎn)的區(qū)域，通過毛細(xì)管電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳精確分析擴(kuò)增產(chǎn)物的長度多態(tài)性。
- InDel標(biāo)記分析： 類似SSR，通過PCR和電泳檢測長度差異。