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小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核檢測

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發(fā)布時間：2025-07-27 00:55:18 更新時間：2025-07-26 00:55:19

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核檢測

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞（Polychromatic Erythrocytes, PCE）微核試驗是一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的體內(nèi)遺傳毒性檢測方法。該試驗主要用于評估化學(xué)物質(zhì)、藥物、環(huán)境污染物或輻射等外源因素對生物體染色體或紡錘體的損傷程度，即潛在的致突變性和遺傳毒性。其原理基于：當(dāng)受試物誘發(fā)染色體斷裂或干擾細(xì)胞有絲分裂時，在細(xì)胞分裂后期，斷裂的染色體片段或整條染色體可能無法被納入主核，進而在細(xì)胞質(zhì)中形成獨立的、體積遠(yuǎn)小于主核的圓形或橢圓形小體，即微核。骨髓中處于旺盛分裂狀態(tài)的幼稚紅細(xì)胞（嗜多染紅細(xì)胞）在分裂成成熟紅細(xì)胞（正染紅細(xì)胞，NCE）時，若含有微核，該微核仍能被保留下來。因此，通過觀察骨髓涂片中嗜多染紅細(xì)胞（PCE）的微核率變化，可以靈敏地反映受試物對染色體或紡錘體的損傷效應(yīng)。該方法具有操作相對簡便、周期短、成本較低、敏感性較高等優(yōu)點，是遺傳毒性評價體系中不可或缺的重要組成部分。

檢測項目

本檢測的核心項目是計算并比較各處理組與對照組小鼠骨髓涂片中嗜多染紅細(xì)胞微核細(xì)胞率（即含有微核的PCE占所觀察PCE總數(shù)的百分比）。此外，通常還需計算嗜多染紅細(xì)胞與正染紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE或PCE/PCE+NCE），該比值反映了骨髓細(xì)胞的增殖活性。PCE/NCE比值的顯著下降可能提示受試物具有明顯的細(xì)胞毒性或抑制骨髓造血功能。

檢測儀器

進行小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核檢測主要需要以下儀器設(shè)備：

光學(xué)顯微鏡：配備油鏡（100倍物鏡）用于觀察和計數(shù)微核，是核心設(shè)備。
血細(xì)胞計數(shù)板：用于實驗前骨髓細(xì)胞懸液的計數(shù)（可選，但有助于調(diào)整細(xì)胞濃度）。
離心機：用于骨髓細(xì)胞懸液的離心沉淀。
恒溫水浴鍋/恒溫箱：用于染色過程中的恒溫孵育。
載玻片及蓋玻片：用于制備骨髓涂片。
研缽/勻漿器：用于分離小鼠股骨或胸骨中的骨髓。
移液器及槍頭：用于試劑的精確移取。

檢測方法

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核檢測的標(biāo)準(zhǔn)流程通常包括以下步驟：

實驗動物處理：選用健康成年小鼠（常用品系如ICR、KM、BALB/c等），隨機分組。給予受試物（通常經(jīng)口灌胃或腹腔注射），并設(shè)置溶劑/賦形劑陰性對照組和已知陽性物（如環(huán)磷酰胺）陽性對照組。采樣時間點通常在一次給藥后的24小時和48小時（或根據(jù)受試物代謝動力學(xué)確定最佳時間）。
骨髓細(xì)胞采集：處死小鼠，剝離股骨或胸骨。用適量小牛血清或生理鹽水沖出骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。
細(xì)胞懸液處理與涂片：將骨髓細(xì)胞懸液離心，棄去部分上清，重懸沉淀。取少量細(xì)胞懸液滴于載玻片一端，用另一載玻片以一定角度推片，制成薄而均勻的骨髓涂片。
涂片固定與染色：空氣干燥后，常用甲醇固定數(shù)分鐘。然后采用Giemsa染色法或Acridine Orange (AO)熒光染色法進行染色。Giemsa染色是最經(jīng)典的方法，染色后PCE呈灰藍(lán)色，NCE呈橘紅色，微核呈深紫紅色或藍(lán)紫色圓形小體，位于PCE細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。AO熒光染色法下，PCE呈紅色熒光，NCE呈綠色熒光，微核呈黃綠色熒光，靈敏度更高。
閱片與計數(shù)：在油鏡下觀察骨髓涂片。選擇細(xì)胞分布均勻、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域。盲法閱片（閱片人不知分組信息）。每只動物至少觀察1000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），記錄其中含有微核的PCE數(shù)（微核細(xì)胞數(shù)）。同時，也需記錄所觀察視野中一定數(shù)量（如200個）的紅細(xì)胞中PCE和NCE的數(shù)量，以計算PCE/NCE比值。微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)：圓形或橢圓形，邊緣光滑清晰，染色與主核一致或略淺，直徑通常小于主核直徑的1/5至1/3，位于胞漿內(nèi)且與主核無連接。注意區(qū)分微核與染色顆粒、雜質(zhì)等。
結(jié)果計算與統(tǒng)計分析：計算每只動物、每組動物的微核細(xì)胞率（‰）和PCE/NCE比值。數(shù)據(jù)通常采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法（如卡方檢驗、Fisher精確檢驗、t檢驗或方差分析等）比較處理組與對照組之間的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗有國際和國內(nèi)廣泛認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)指南，確保試驗的科學(xué)性、規(guī)范性和結(jié)果的可比性：

OECD 測試指南 474：《哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗》(Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test)。這是國際上最權(quán)威的指南，詳細(xì)規(guī)定了試驗的原則、方法、動物選擇、劑量設(shè)計、對照設(shè)置、采樣時間、閱片計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果評價和數(shù)據(jù)報告要求。
中國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 21751-2008：《化學(xué)品哺乳動物骨髓染色體畸變試驗方法》。該標(biāo)準(zhǔn)主要借鑒了OECD 474等國際指南，是中國境內(nèi)進行化學(xué)品遺傳毒性評價（包括微核試驗）的官方標(biāo)準(zhǔn)。
ICH S2(R1) 指導(dǎo)原則：《人用藥物遺傳毒性試驗和結(jié)果分析指導(dǎo)原則》。該指導(dǎo)原則雖非專門針對微核試驗，但對于藥物研發(fā)中遺傳毒性評價策略和微核試驗的應(yīng)用有重要指導(dǎo)作用。

結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：通常，如果受試物在一個或多個劑量組中，微核細(xì)胞率與陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著增加（P<0.05或P<0.01），并且呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，或者微核細(xì)胞率增加具有生物學(xué)意義（即使未達(dá)統(tǒng)計顯著但在歷史對照范圍內(nèi)異常高），則判定該受試物在本試驗系統(tǒng)結(jié)果為陽性（即具有誘發(fā)染色體損傷的潛力）。同時，PCE/NCE比值顯著下降提示細(xì)胞毒性作用，也是結(jié)果解釋的重要參考。陰性對照組微核率通常在正常范圍內(nèi)（通常<3‰）。陽性對照組微核率應(yīng)顯著高于陰性對照組，以證明試驗系統(tǒng)的敏感性。