副溶血性弧菌耐熱溶血素(TDH)測(cè)定檢測(cè)

副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）是一種廣泛分布于海水、海底沉積物及魚貝類等海產(chǎn)品中的革蘭氏陰性嗜鹽菌，是引發(fā)細(xì)菌性食物中毒的重要病原體之一。其致病性與多種毒力因子相關(guān)，其中耐熱直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin, TDH）是最關(guān)鍵的毒力因子和標(biāo)志性毒素。TDH具有耐熱性（100°C加熱10分鐘仍保留部分活性），能溶解人或兔的紅細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致組織損傷和腹瀉等癥狀。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)副溶血性弧菌是否產(chǎn)生TDH及其含量，不僅是判斷菌株潛在致病性的核心依據(jù)，也是評(píng)估食品安全風(fēng)險(xiǎn)、追溯食源性疾病暴發(fā)源頭以及制定有效防控措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

檢測(cè)項(xiàng)目

本檢測(cè)的核心項(xiàng)目是：副溶血性弧菌耐熱直接溶血素（TDH）的定性或半定量測(cè)定。具體包括：

1. 定性檢測(cè)： 判定被檢副溶血性弧菌菌株是否具有產(chǎn)生TDH的能力（通常報(bào)告為TDH陽(yáng)性或陰性）。
2. 半定量檢測(cè)（溶血效價(jià)測(cè)定）： 測(cè)定TDH溶解特定紅細(xì)胞（通常是兔或人“O”型紅細(xì)胞）的能力強(qiáng)度，以溶血單位或最高溶血稀釋度表示。
3. 菌株致病性評(píng)估： 根據(jù)TDH檢測(cè)結(jié)果（特別是“神奈川現(xiàn)象”Kanagawa Phenomenon, KP）判斷分離菌株的潛在致病性。絕大多數(shù)臨床致病株為TDH陽(yáng)性（KP陽(yáng)性），而環(huán)境分離株多為TDH陰性（KP陰性）。

檢測(cè)儀器

進(jìn)行TDH測(cè)定主要依賴基礎(chǔ)微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和耗材：

1. 恒溫培養(yǎng)箱： 用于細(xì)菌培養(yǎng)，通常設(shè)定在35-37°C。
2. 恒溫水浴鍋： 用于精確控制溶血試驗(yàn)的反應(yīng)溫度（通常為37°C），以及樣品的加熱處理（用于證明耐熱性）。
3. 離心機(jī)： 用于洗滌和制備紅細(xì)胞懸液。
4. 無(wú)菌操作設(shè)備： 生物安全柜（BSC）或超凈工作臺(tái)，確保無(wú)菌操作。
5. 分光光度計(jì)： 用于定量測(cè)定溶血后上清液中的血紅蛋白釋放量（吸光度），進(jìn)行半定量分析。
6. 微量移液器及槍頭： 用于精確移取液體。
7. 培養(yǎng)皿、試管、微孔板： 用于細(xì)菌培養(yǎng)、制備菌液和進(jìn)行溶血試驗(yàn)（試管法或微孔板法）。
8. pH計(jì)： 用于精確配置緩沖液。

檢測(cè)方法

TDH測(cè)定的經(jīng)典和常用方法是神奈川試驗(yàn)（Kanagawa Test），即溶血試驗(yàn)，主要步驟為：

1. 菌株培養(yǎng)與菌液制備： 將純化的副溶血性弧菌可疑菌落接種于含3% NaCl的心腦浸液肉湯（BHI）或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）中，35-37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。離心收集上清液（含分泌的TDH）。
2. 紅細(xì)胞懸液制備： 無(wú)菌采集兔或人“O”型抗凝血，用生理鹽水或PBS（含3% NaCl以維持滲透壓）洗滌紅細(xì)胞3-4次至上清液澄清。最后將洗滌好的紅細(xì)胞配制成2%的紅細(xì)胞懸液（于含3% NaCl的PBS中）。
3. 溶血試驗(yàn)（試管法）：

• 取一系列小試管（如10×75mm）。
• 在試管中加入0.5mL 2%紅細(xì)胞懸液。
• 加入0.5mL細(xì)菌培養(yǎng)上清液（試驗(yàn)管）。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（0.5mL無(wú)菌肉湯 + 0.5mL紅細(xì)胞懸液）和陽(yáng)性對(duì)照（已知TDH陽(yáng)性菌株上清液）。
• 輕輕混勻，置于37°C恒溫水浴鍋中孵育。
• 孵育時(shí)間通常為1-2小時(shí)，期間可定時(shí)觀察（如30分鐘、60分鐘、120分鐘）。完全溶血表現(xiàn)為透明、鮮紅色上清液（血紅蛋白釋放），管底無(wú)紅細(xì)胞沉淀；部分溶血為混濁紅色上清液；不溶血?jiǎng)t紅細(xì)胞完全沉淀，上清液澄清無(wú)色。

4. 耐熱性驗(yàn)證（可選）： 取部分培養(yǎng)上清液于100°C水浴加熱10分鐘，冷卻后按上述步驟進(jìn)行溶血試驗(yàn)。真正的TDH具有耐熱性，加熱后仍能溶血（強(qiáng)度可能減弱）。
5. 半定量測(cè)定（溶血效價(jià)）： 將培養(yǎng)上清液用含3% NaCl的PBS進(jìn)行系列倍比稀釋（如1:2, 1:4, 1:8...）。取不同稀釋度的上清液各0.5mL，分別與0.5mL 2%紅細(xì)胞懸液混合，37°C孵育1-2小時(shí)。能引起完全溶血（或50%溶血）的最高稀釋倍數(shù)即為該菌株的TDH溶血效價(jià)。
6. 微孔板法： 原理同試管法，操作在96孔板中進(jìn)行，更節(jié)省試劑，便于高通量檢測(cè)和光度計(jì)讀數(shù)。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

副溶血性弧菌TDH檢測(cè)遵循的主要標(biāo)準(zhǔn)包括：

1. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：

• 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.7-2013 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》。該標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了副溶血性弧菌的神奈川試驗(yàn)（溶血試驗(yàn)）作為檢測(cè)TDH和判定菌株致病性的推薦方法，詳細(xì)描述了檢測(cè)步驟和結(jié)果判讀要求。

2. 國(guó)際參考方法：

• 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的《細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)》（Bacteriological Analytical Manual, BAM）中關(guān)于副溶血性弧菌的章節(jié)。
• 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）標(biāo)準(zhǔn) ISO 21872-1:2017 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of *Vibrio* spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic *Vibrio parahaemolyticus*, *Vibrio cholerae* and *Vibrio vulnificus*》。該標(biāo)準(zhǔn)也包含了通過(guò)溶血試驗(yàn)進(jìn)行TDH檢測(cè)（神奈川現(xiàn)象）作為毒力指示的方法。

3. 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：

• 神奈川現(xiàn)象（KP）陽(yáng)性： 在規(guī)定的孵育時(shí)間內(nèi)（通?！?4小時(shí)）試驗(yàn)管出現(xiàn)完全溶血（透明鮮紅上清），而陰性對(duì)照管無(wú)溶血。表明該菌株產(chǎn)生TDH，具有潛在致病性。
• 神奈川現(xiàn)象（KP）陰性： 試驗(yàn)管在孵育時(shí)間內(nèi)無(wú)溶血或僅輕微溶血（紅細(xì)胞沉淀，上清澄清或輕微變紅）。表明該菌株不產(chǎn)生或極少產(chǎn)生TDH，通常認(rèn)為無(wú)致病性或致病性弱。

這些標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行規(guī)范、準(zhǔn)確和可比的副溶血性弧菌TDH檢測(cè)提供了權(quán)威依據(jù)。