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載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-26 18:32:43 更新時(shí)間：2025-07-25 18:32:43

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)檢測(cè)

載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)檢測(cè)是評(píng)價(jià)消毒劑、抗菌材料或消毒技術(shù)對(duì)特定微生物殺滅效果的常用實(shí)驗(yàn)室方法之一。該方法通過(guò)將染有標(biāo)準(zhǔn)致病菌株的特定載體（如布片、金屬環(huán)、塑料片等）完全浸泡于待測(cè)消毒劑溶液中作用規(guī)定時(shí)間，然后通過(guò)微生物培養(yǎng)技術(shù)定性判斷其殺菌能力。該試驗(yàn)高度模擬實(shí)際消毒場(chǎng)景（如醫(yī)療器械浸泡消毒、物體表面擦拭消毒等），尤其適用于評(píng)估消毒劑在實(shí)際應(yīng)用條件下對(duì)附著在載體上的微生物的殺滅效果，是消毒產(chǎn)品注冊(cè)備案、消毒效果驗(yàn)證及質(zhì)量控制的重要依據(jù)。定性試驗(yàn)的核心在于判斷微生物是否被殺滅至不可檢出的水平，其結(jié)果通常表示為“有菌生長(zhǎng)”或“無(wú)菌生長(zhǎng)”。相較于定量殺菌試驗(yàn)，定性方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，適用于快速篩選或初步評(píng)價(jià)消毒產(chǎn)品的殺菌效能，但也需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和條件控制。

檢測(cè)項(xiàng)目

載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)主要檢測(cè)以下核心項(xiàng)目：

1. 殺菌率/殺滅對(duì)數(shù)值： 雖為定性試驗(yàn)（陽(yáng)性/陰性結(jié)果），但通過(guò)設(shè)置不同作用時(shí)間點(diǎn)或不同濃度組，可定性判斷達(dá)到完全殺滅所需的最低有效濃度（MBC）或最短作用時(shí)間。結(jié)果通常表述為在特定濃度和作用時(shí)間下，對(duì)指定微生物是否達(dá)到完全殺滅（所有重復(fù)載體無(wú)菌生長(zhǎng)）。

2. 目標(biāo)微生物種類： 試驗(yàn)針對(duì)的具體微生物，通常包括：
* 細(xì)菌繁殖體：如金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大腸桿菌 (ATCC 25922)、銅綠假單胞菌 (ATCC 15442)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 等標(biāo)準(zhǔn)菌株。
* 細(xì)菌芽孢：如枯草桿菌黑色變種芽孢 (ATCC 9372)，用于評(píng)價(jià)高水平消毒劑或滅菌劑效果。
* 分枝桿菌：如結(jié)核分枝桿菌或龜分枝桿菌膿腫亞種，評(píng)價(jià)中水平消毒劑效果。

3. 載體類型適用性： 驗(yàn)證消毒劑在不同材質(zhì)載體（如布片、不銹鋼片、玻璃片、塑料片、有機(jī)土壤載體等）上殺滅微生物的效果。

4. 影響因素評(píng)價(jià)： 可定性評(píng)估有機(jī)物干擾（如加入小牛血清）、溫度、pH值等因素對(duì)消毒劑殺菌效果的影響。

檢測(cè)儀器

進(jìn)行載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)需配備以下主要儀器設(shè)備：

1. 微生物實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備：
* 生物安全柜： 提供無(wú)菌操作環(huán)境，保護(hù)操作人員和環(huán)境。
* 恒溫培養(yǎng)箱： 用于細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)，常用溫度如36±1°C（細(xì)菌）、28±1°C（真菌）。
* 恒溫水浴箱： 精確控制消毒劑作用溫度。
* 高壓蒸汽滅菌器： 用于培養(yǎng)基、稀釋液、器械、載體等的滅菌。
* 干燥箱： 用于滅菌后載體的烘干。

2. 樣品處理設(shè)備：
* 精密計(jì)時(shí)器： 精確控制消毒劑作用時(shí)間。
* 移液器及無(wú)菌吸頭： 精確移取液體樣品、菌懸液和稀釋液。
* 渦旋振蕩器： 混勻樣品和稀釋液。
* 無(wú)菌鑷子、剪刀、試管、平皿： 用于無(wú)菌操作和處理載體。

3. 載體制作與處理設(shè)備：
* 打孔器/載體模具： 制備規(guī)格統(tǒng)一的載體（如直徑約1cm的布片）。
* 載體浸泡容器： 如無(wú)菌燒杯、帶蓋試管架或?qū)Ｓ枚嗫捉莅澹_保載體完全浸沒(méi)。

4. 菌種保藏與復(fù)蘇設(shè)備：
* 冰箱： 保存標(biāo)準(zhǔn)菌種及培養(yǎng)基。
* 菌種復(fù)蘇設(shè)備： 如接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)基等。

檢測(cè)方法

載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)流程主要包括以下步驟：

1. 試驗(yàn)前準(zhǔn)備：
* 標(biāo)準(zhǔn)菌株活化與傳代：復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株，經(jīng)2-3代培養(yǎng)至穩(wěn)定期，制備濃度約為1×10?-5×10? CFU/mL的菌懸液。
* 載體滅菌與干燥：將規(guī)定材質(zhì)（如布片）的載體清洗干凈，高壓蒸汽滅菌，烘干備用。
* 消毒劑配制：用無(wú)菌硬水（或規(guī)定溶劑）將消毒劑稀釋至所需試驗(yàn)濃度。
* 中和劑選擇與鑒定：選擇能有效中和消毒劑且對(duì)微生物無(wú)毒性的中和劑，并進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)驗(yàn)證。

2. 載體染菌：
* 將滅菌干燥的載體無(wú)菌操作浸入菌懸液中，確保完全濕潤(rùn)。
* 取出載體，瀝干多余菌液（通常在無(wú)菌濾紙上吸干或自然瀝干），使其攜帶定量活菌（通常目標(biāo)染菌量為5×10? - 5×10? CFU/片）。

3. 消毒劑浸泡處理：
* 將染菌載體無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移至裝有規(guī)定體積消毒劑溶液的容器中，確保載體完全浸沒(méi)。
* 立即計(jì)時(shí)，在規(guī)定的恒定溫度（如20±1°C）下作用設(shè)定的時(shí)間（如1min, 5min, 10min等）。
* 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（染菌載體加入稀釋液代替消毒劑）和陰性對(duì)照組（未染菌載體加入消毒劑）。

4. 終止反應(yīng)與中和：
* 作用時(shí)間到達(dá)后，立即用無(wú)菌鑷子取出載體，投入裝有足量中和劑的試管或容器中。
* 充分振蕩或混勻，確保消毒作用被有效中和。

5. 微生物培養(yǎng)與結(jié)果判定：
* 將中和后的載體（或連同中和液）轉(zhuǎn)種至合適的固體培養(yǎng)基（如營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SDA瓊脂）上。
* 置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌通常37°C培養(yǎng)48小時(shí)，真菌28°C培養(yǎng)72小時(shí)）。
* 觀察培養(yǎng)結(jié)果：
- 陰性（無(wú)菌生長(zhǎng)）： 培養(yǎng)基上無(wú)任何目標(biāo)微生物菌落生長(zhǎng)。該組載體對(duì)應(yīng)的消毒劑處理?xiàng)l件達(dá)到了定性完全殺滅。
- 陽(yáng)性（有菌生長(zhǎng)）： 培養(yǎng)基上可見(jiàn)目標(biāo)微生物的典型菌落生長(zhǎng)。該組載體對(duì)應(yīng)的消毒劑處理?xiàng)l件未能完全殺滅微生物。
* 結(jié)果報(bào)告：報(bào)告在特定消毒劑濃度、作用時(shí)間、溫度條件下，對(duì)指定載體上的目標(biāo)微生物是否達(dá)到完全殺滅。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)必須嚴(yán)格遵循國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，確保試驗(yàn)的規(guī)范性、可比性和可靠性。主要參考標(biāo)準(zhǔn)包括：

1. 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) (GB)：
* GB/T 38502-2020 《消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法》： 該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了包括載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)在內(nèi)的多種消毒劑殺菌效果評(píng)價(jià)方法，對(duì)試驗(yàn)菌株、載體、培養(yǎng)基、試驗(yàn)條件、操作步驟及結(jié)果判定等均有明確要求。
* GB 15981-2012 《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》： 提供了消毒與滅菌效果評(píng)價(jià)的通用原則和要求，是載體試驗(yàn)的重要指導(dǎo)文件。
* 其他相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中也可能包含特定的載體浸泡試驗(yàn)要求。

2. 衛(wèi)生部規(guī)范：
* 《消毒技術(shù)規(guī)范》（最新版）： 這是中國(guó)消毒領(lǐng)域最核心的技術(shù)法規(guī)。其中關(guān)于“消毒劑消毒效果定性試驗(yàn)（載體法）”的部分對(duì)載體浸泡定性殺菌試驗(yàn)的操作細(xì)節(jié)、結(jié)果判定有非常具體的規(guī)定，是實(shí)際工作中最常依據(jù)的操作規(guī)程。

3. 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：
* EN 13697:2015 《Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative non-porous surface test for the evaluation of bactericidal and/or fungicidal activity of chemical disinfectants used in food, industrial, domestic and institutional areas - Test method and requirements without mechanical action》：雖然主要是定量方法