皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗（皮膚/黏膜試驗）概述

皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗（Skin Sensitization Test），也稱為過敏性接觸性皮炎試驗，是評估化學(xué)物質(zhì)、化妝品、醫(yī)療器械、藥品等外源性物質(zhì)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（IV型變態(tài)反應(yīng)）潛力的關(guān)鍵毒理學(xué)檢測手段。該試驗通過模擬人體或動物皮膚/黏膜接觸受試物后的免疫應(yīng)答過程，預(yù)測其致敏風(fēng)險，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品安全性評價、職業(yè)健康防護及法規(guī)注冊等領(lǐng)域。試驗核心在于識別物質(zhì)是否具備成為致敏原的潛力，以及量化其致敏強度，為風(fēng)險評估和標(biāo)簽警示提供科學(xué)依據(jù)。

皮膚變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生涉及復(fù)雜的免疫機制，主要包括致敏（誘導(dǎo)）和激發(fā)兩個階段。在致敏階段，小分子半抗原穿透皮膚屏障與載體蛋白結(jié)合形成完全抗原，被表皮朗格漢斯細胞捕獲、加工并提呈給T淋巴細胞，誘導(dǎo)特異性記憶T細胞克隆增殖。在激發(fā)階段，當(dāng)機體再次接觸相同致敏原時，活化的記憶T細胞釋放炎癥因子，招募效應(yīng)細胞，導(dǎo)致局部皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹甚至水皰等典型的炎癥反應(yīng)。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗正是通過科學(xué)設(shè)計的模型重現(xiàn)這一過程，評估物質(zhì)的致敏性。

依據(jù)試驗載體和目標(biāo)，皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗主要分為兩大類：體內(nèi)試驗（In Vivo）和體外試驗（In Vitro）。體內(nèi)試驗直接在人體志愿者（斑貼試驗）或?qū)嶒瀯游铮ㄈ珉嗍?、小鼠）的完整皮膚/黏膜上進行；體外試驗則利用離體皮膚模型、重組人表皮、或特定細胞系（如樹突狀細胞、角質(zhì)形成細胞）在實驗室條件下評估物質(zhì)的致敏潛能。隨著3R原則（替代、減少、優(yōu)化）的推進和技術(shù)的進步，體外替代方法正日益成為重要的研究和發(fā)展方向。

檢測項目

皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗涵蓋一系列具體的檢測項目，針對不同的應(yīng)用場景和測試目的：

1. 人體試驗：

• 人體重復(fù)性斑貼試驗（HRIPT / RIPT）： 評估物質(zhì)在人體皮膚反復(fù)暴露下的致敏風(fēng)險，常用于化妝品終產(chǎn)品安全性確認。
• 人體最大化試驗（HMT）： 采用高濃度和封閉斑貼以最大化激發(fā)潛在致敏性，用于新原料或高關(guān)注物質(zhì)的風(fēng)險篩查。
• 光斑貼試驗： 專門評估物質(zhì)在光照（通常是UVA）條件下引發(fā)光敏反應(yīng)（光毒性或光變態(tài)反應(yīng)）的可能性。
• 黏膜刺激性與過敏性試驗： 針對可能接觸眼、口腔、生殖器等黏膜部位的產(chǎn)品（如滴眼液、漱口水、避孕產(chǎn)品），評估其在黏膜部位的致敏潛能。

2. 動物試驗（傳統(tǒng)）：

• 豚鼠最大化試驗（GPMT）： 經(jīng)典的動物模型，通過皮內(nèi)注射誘導(dǎo)和表皮涂抹激發(fā)來評估強致敏原。
• 豚鼠封閉斑貼試驗（Buehler Test）： 僅通過表皮涂抹進行誘導(dǎo)和激發(fā)，適用于評估較弱致敏原。

3. 體外替代方法（OECD認可）：

• 局部淋巴結(jié)試驗（LLNA）： 測量小鼠耳部接觸受試物后引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞增殖程度（放射性或非放射性方法），量化致敏強度（EC3值）。
• 人細胞系活化試驗（h-CLAT）： 利用人源THP-1細胞系（單核細胞/樹突樣細胞），檢測受試物刺激后細胞表面CD86和CD54表達的上調(diào)，指示樹突細胞活化（致敏關(guān)鍵事件）。
• 直接多肽反應(yīng)試驗（DPRA）： 評估受試物與模型肽（半胱氨酸、賴氨酸）的反應(yīng)性（共價結(jié)合），模擬半抗原化過程。
• ARE-Nrf2熒光素酶試驗（KeratinoSens? / LuSens）： 利用基因工程改造的人角質(zhì)形成細胞系，檢測受試物誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）驅(qū)動的熒光素酶基因表達，反映Keap1-Nrf2通路激活（皮膚致敏關(guān)鍵事件）。
• 重組人表皮模型試驗（如EpiSensA?）： 使用重建的人表皮組織，檢測受試物暴露后炎癥相關(guān)標(biāo)志物（如IL-18）的釋放。

檢測儀器

進行皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗涉及多種精密儀器：

• 斑貼試驗器/斑試器： 用于固定受試物到人體或動物皮膚（如Finn Chamber?, IQ Chamber?），材質(zhì)需惰性（鋁、塑料）。
• 封閉敷料： 醫(yī)用膠帶（如Scanpor?）、繃帶、專用固定帶，確保斑試器貼合且封閉。
• 光源系統(tǒng)： 光斑貼試驗專用的紫外線A（UVA）光源設(shè)備，精確控制照射劑量。
• 顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)： 觀察和記錄皮膚反應(yīng)（紅斑、水腫評分）及動物淋巴結(jié)形態(tài)學(xué)變化。
• 細胞培養(yǎng)設(shè)備： CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡、離心機等，用于體外細胞試驗。
• 流式細胞儀（FACS）： 檢測h-CLAT等試驗中細胞表面標(biāo)志物（CD86, CD54）的表達水平。
• 酶標(biāo)儀/微孔板讀數(shù)儀： 用于讀取DPRA（HPLC-UV）、LLNA（BrdU或ATP法）、ARE試驗（熒光素酶活性）中的吸光度（OD值）、熒光或化學(xué)發(fā)光信號。
• 高效液相色譜儀（HPLC）： DPRA試驗中定量分析模型肽的消耗。
• 液體閃爍計數(shù)器或熒光/發(fā)光微孔板讀數(shù)儀： 傳統(tǒng)LLNA（放射性）或非放射性LLNA（如BrdU-ELISA, ATP檢測）的數(shù)據(jù)采集。
• ELISA設(shè)備： 檢測細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿中的細胞因子（如IL-18）。

檢測方法

不同檢測項目有標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，以下簡述關(guān)鍵方法：

1. 局部淋巴結(jié)試驗（LLNA，如OECD TG 429）：

1. 動物準(zhǔn)備： 選用雌性小鼠（如CBA/Ca或CBA/J）。
2. 給藥：
3. 誘導(dǎo)期： 連續(xù)3天在動物雙耳背側(cè)涂抹不同濃度的受試物或?qū)φ杖軇?/li>
4. 標(biāo)記： 第5天，靜脈注射放射性標(biāo)記的胸苷（[3H]-TdR）或溴脫氧尿苷（BrdU）或腹腔注射ATP檢測試劑。
5. 取樣： 第6天，處死動物，摘取雙側(cè)耳后引流淋巴結(jié)。
6. 測量： 放射性法：液體閃爍計數(shù)儀測量淋巴結(jié)摻入的放射性強度；BrdU法：ELISA檢測淋巴結(jié)細胞中BrdU含量；ATP法：檢測淋巴結(jié)細胞的ATP含量（反映細胞活性/增殖）。
7. 計算刺激指數(shù)（SI）：（處理組平均dpm或等效值）/（溶劑對照組平均dpm或等效值）。若SI≥3，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系，則判為陽性。計算EC3值（引起SI=3的受試物濃度）。