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致瀉大腸埃希菌檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-21 18:27:59 更新時(shí)間：2025-07-20 18:27:59

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

致瀉大腸埃希菌檢測(cè)：守護(hù)食品與公共衛(wèi)生安全的關(guān)鍵防線

大腸埃希菌（*Escherichia coli*），通常稱為大腸桿菌，是人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常菌群之一。然而，某些特定血清型或攜帶特定毒力基因的大腸埃希菌菌株具有致病性，能引起人類嚴(yán)重的胃腸炎，統(tǒng)稱為致瀉大腸埃希菌（Diarrheagenic *E. coli*, DEC）。這些致病菌株主要通過(guò)污染的水源、食物（尤其是未煮熟的肉類、生鮮蔬果、生乳及其制品）或人與人接觸傳播，是引起旅行者腹瀉、嬰幼兒腹瀉甚至溶血性尿毒綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要病原體。由于其引起的疾病癥狀多樣，從輕度腹瀉到危及生命的重癥不等，且傳播迅速，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成顯著威脅。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的致瀉大腸埃希菌檢測(cè)體系，對(duì)于食源性疾病暴發(fā)的溯源調(diào)查、食品安全監(jiān)管、臨床診斷治療以及預(yù)防控制措施的制定至關(guān)重要。

檢測(cè)項(xiàng)目

致瀉大腸埃希菌檢測(cè)的核心目標(biāo)是識(shí)別和確認(rèn)樣品（如食品、水、糞便、環(huán)境樣本）中是否存在特定的致病性大腸埃希菌菌株，并盡可能區(qū)分其致病型別。主要的檢測(cè)項(xiàng)目包括：

1. 總大腸菌群/大腸埃希菌計(jì)數(shù)：常作為衛(wèi)生學(xué)指示指標(biāo)，初步評(píng)估樣品污染程度。

2. 目標(biāo)致病菌株的分離與鑒定：針對(duì)不同類型的致瀉大腸埃希菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，主要包括： * 腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌：檢測(cè)不耐熱腸毒素和/或耐熱腸毒素。 * 腸致病性大腸埃希菌：檢測(cè)特定的血清型（如O55， O111， O114等）和/或毒力基因。 * 腸侵襲性大腸埃希菌：檢測(cè)其侵襲上皮細(xì)胞的能力或相關(guān)基因。 * 腸出血性大腸埃希菌/產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌：這是檢測(cè)的重中之重，特別是O157:H7血清型，以及重要的非O157血清型（如O26， O45， O103， O104， O111， O121， O145等），核心是檢測(cè)志賀毒素和/或相應(yīng)的基因。 * 腸集聚性大腸埃希菌：檢測(cè)其特殊的粘附模式或相關(guān)基因。 * 彌散粘附性大腸埃希菌：檢測(cè)其彌散粘附特性或相關(guān)基因。

3. 毒力因子檢測(cè)：直接檢測(cè)關(guān)鍵的毒力基因（如stx1, stx2, eae, bfp, ipaH, elt, est, aggR, astA等）或表達(dá)的毒素（如志賀毒素）。

4. 血清分型：確定分離株的O抗原（菌體）和H抗原（鞭毛）型別。

5. 分子分型：用于暴發(fā)溯源，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳、多位點(diǎn)序列分型或全基因組測(cè)序。

檢測(cè)儀器

致瀉大腸埃希菌檢測(cè)是一個(gè)多步驟過(guò)程，涉及多種儀器設(shè)備：

1. 樣品制備設(shè)備：均質(zhì)器/拍打式均質(zhì)器、離心機(jī)、漩渦混合器、水浴鍋/金屬浴、微量移液器。

2. 培養(yǎng)與分離設(shè)備： * 恒溫培養(yǎng)箱（用于35-37°C常規(guī)培養(yǎng)，有時(shí)需要特定溫度如44°C用于選擇性增菌）。 * 厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)（針對(duì)某些特定菌）。 * 微生物自動(dòng)接種儀（可選）。

3. 生化鑒定設(shè)備： * 生化反應(yīng)管/板。 * 自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)（如VITEK 2， BD Phoenix, MicroScan WalkAway等）。

4. 免疫學(xué)檢測(cè)設(shè)備： * 酶標(biāo)儀（用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）。 * 免疫磁珠分離系統(tǒng)（常用于EHEC/O157:H7的富集）。 * 側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l閱讀儀（可選，用于快速檢測(cè)試紙條結(jié)果判讀）。

5. 分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備（核心）： * 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：用于靶基因的擴(kuò)增，是檢測(cè)毒力基因的金標(biāo)準(zhǔn)方法之一。包括常規(guī)PCR儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀可同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和檢測(cè)，具有速度快、靈敏度高、可定量（相對(duì)）、閉管操作減少污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)。 * 核酸提取純化系統(tǒng)：手動(dòng)或自動(dòng)化設(shè)備，用于從樣本中提取高質(zhì)量DNA/RNA。 * 電泳系統(tǒng)：用于常規(guī)PCR產(chǎn)物的分離和可視化（瓊脂糖凝膠電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)）。 * 恒溫?cái)U(kuò)增設(shè)備：如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增儀，操作更簡(jiǎn)單快速。

6. 血清學(xué)分型設(shè)備：玻片、凝集反應(yīng)板等。

7. 菌種保存設(shè)備：超低溫冰箱（-70°C或以下）、液氮罐。

檢測(cè)方法

致瀉大腸埃希菌的檢測(cè)方法多樣，通常根據(jù)檢測(cè)目的、樣本類型、時(shí)效要求和實(shí)驗(yàn)室條件選擇或組合使用：

1. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法： * 原理：利用選擇性培養(yǎng)基分離目標(biāo)菌，通過(guò)菌落形態(tài)、生化反應(yīng)（如IMViC試驗(yàn)）、血清學(xué)凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。 * 步驟：樣品前處理→選擇性增菌（如mEC+n肉湯）→選擇性平板分離（如麥康凱瓊脂、山梨醇麥康凱瓊脂、顯色培養(yǎng)基）→可疑菌落挑選→生化鑒定→血清學(xué)分型→毒力試驗(yàn)（細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物試驗(yàn)，現(xiàn)已較少用）或毒力基因檢測(cè)。 * 特點(diǎn)：是基礎(chǔ)方法，可分離活菌用于后續(xù)研究，但耗時(shí)長(zhǎng)（通常4-7天），步驟繁瑣，靈敏度易受干擾。

2. 免疫學(xué)方法： * 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：檢測(cè)菌體抗原（如O157抗原）或毒素（如志賀毒素）。 * 免疫磁珠分離：利用特異性抗體包被的磁珠富集目標(biāo)菌（如O157），顯著提高后續(xù)培養(yǎng)或檢測(cè)的靈敏度。 * 乳膠凝集試驗(yàn)：用于菌落或增菌液的血清型快速初步鑒定。 * 側(cè)向?qū)游雒庖邔游鲈嚰垪l：快速檢測(cè)抗原或毒素，適合現(xiàn)場(chǎng)篩查。 * 特點(diǎn)：相對(duì)快速（幾小時(shí)至一天），操作較簡(jiǎn)便，但可能存在交叉反應(yīng)，靈敏度有時(shí)不如分子方法。

3. 分子生物學(xué)方法（目前主流和趨勢(shì)）： * 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)： * 常規(guī)PCR：擴(kuò)增特定毒力基因（如stx1, stx2, eae），通過(guò)凝膠電泳判斷結(jié)果?？蛇M(jìn)行多重PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。 * 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在擴(kuò)增過(guò)程中通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量，無(wú)需開(kāi)蓋，大大減少污染，靈敏度高，可定量，速度快（通常2-4小時(shí)出結(jié)果），且可設(shè)計(jì)多重檢測(cè)。是目前檢測(cè)毒力基因最常用、最靈敏可靠的方法之一。也可設(shè)計(jì)血清型特異性引物/探針進(jìn)行鑒定。 * 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：在恒定溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，設(shè)備要求低，速度快（通常1小時(shí)內(nèi)），適合現(xiàn)場(chǎng)或資源有限地區(qū)使用。 * 基因芯片/DNA微陣列：可高通量檢測(cè)大量毒力基因和血清型標(biāo)記物。 * 全基因組測(cè)序：提供最全面的信息，用于精準(zhǔn)分型、溯源和毒力因子分析，成本高且數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，主要用于研究或暴發(fā)調(diào)查。 * 特點(diǎn)：特異性高，靈敏度高，速度快（尤其qPCR和LAMP），可直接檢測(cè)樣本（有時(shí)需增菌），能區(qū)分致瀉類型。是快速確診和篩查的首選。

方法選擇通常需要結(jié)合。例如，在食品檢測(cè)中常采用：樣品增菌 → 免疫磁珠富集 → 平板分離培養(yǎng) → 菌落PCR/qPCR確認(rèn)毒力基因；或者增菌后直接