止血海綿溶血試驗(yàn)：評(píng)估血液相容性的關(guān)鍵步驟

止血海綿作為直接接觸血液的醫(yī)療器械，其生物相容性至關(guān)重要。其中，溶血試驗(yàn)是評(píng)估其是否會(huì)引起紅細(xì)胞破裂（溶血）的關(guān)鍵體外測試，直接關(guān)系到產(chǎn)品的臨床安全性。本試驗(yàn)?zāi)M止血海綿與血液接觸的場景，定量檢測其引發(fā)溶血的程度。

一、 試驗(yàn)?zāi)康呐c原理

• 目的： 評(píng)價(jià)止血海綿或其浸提液是否會(huì)引起紅細(xì)胞溶解，釋放血紅蛋白，從而判斷其對(duì)紅細(xì)胞的破壞程度。這是評(píng)估醫(yī)療器械血液相容性的基本要求之一。
• 原理： 將止血海綿樣本（或浸提液）與稀釋的抗凝新鮮血液（通常為兔血或人血）在特定條件下（如37℃）共同孵育一定時(shí)間。紅細(xì)胞膜若受到材料中化學(xué)物質(zhì)或物理作用的損傷，會(huì)破裂并釋放出血紅蛋白。通過離心分離未溶解的紅細(xì)胞后，測定上清液中游離血紅蛋白的濃度，計(jì)算相對(duì)于陽性對(duì)照（通常為蒸餾水，引起完全溶血）和陰性對(duì)照（通常為生理鹽水，不引起溶血）的溶血率，以此量化材料的溶血潛能。

二、 試驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)主要遵循國際公認(rèn)的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：

• ISO 10993-4： 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇》
• ISO 10993-5： 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》（雖然主要針對(duì)細(xì)胞毒性，但溶血試驗(yàn)常被包含或參照其原則）
• GB/T 16886.4 / GB/T 16886.5： 中國國家標(biāo)準(zhǔn)（等同采用ISO 10993-4 / 10993.5）。

三、 主要試驗(yàn)材料與試劑

1. 止血海綿樣品：
   • 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求制備一定表面積或質(zhì)量的樣品。
   • 直接接觸法： 將樣品切割成適宜大小的小塊。
   • 浸提法： 將樣品按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定比例（如0.2g/mL或6cm²/mL）浸入生理鹽水或適宜的溶劑中，在一定溫度（如37℃或50℃、70℃）下提取規(guī)定時(shí)間（如24小時(shí)、72小時(shí)），取上清液作為測試液。浸提條件需根據(jù)產(chǎn)品特性和預(yù)期臨床應(yīng)用選擇。
2. 抗凝全血： 新鮮采集的健康兔血或人血（通常建議使用兔血），使用適宜的肝素鈉或枸櫞酸鈉溶液抗凝。
3. 陰性對(duì)照： 生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）。
4. 陽性對(duì)照： 蒸餾水或去離子水（確保完全溶血）。
5. 稀釋液： 生理鹽水，用于稀釋血液。
6. 離心管、移液器、吸頭、試管等。
7. 恒溫水浴箱： 維持（37±1）℃。
8. 離心機(jī)。
9. 分光光度計(jì)： 用于測定上清液吸光度（常用波長540nm或545nm附近血紅蛋白的最大吸收峰）。

四、 試驗(yàn)步驟概要

1. 血液稀釋： 將抗凝全血用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度（如4%或8% V/V），制備成稀釋兔血（或人血）。
2. 樣品/浸提液準(zhǔn)備： 準(zhǔn)備好止血海綿樣品塊或浸提液。
3. 分組與加樣（示例）：
   • 空白對(duì)照組： 生理鹽水 + 稀釋血液。
   • 陰性對(duì)照組： 生理鹽水 + 稀釋血液。
   • 陽性對(duì)照組： 蒸餾水 + 稀釋血液。
   • 樣品組： 止血海綿樣品/浸提液 + 稀釋血液。
   • (每組通常設(shè)平行樣)
4. 孵育： 將各組試管輕輕混勻，置于（37±1）℃恒溫水浴中孵育規(guī)定時(shí)間（通常為3±0.1小時(shí)）。
5. 離心： 孵育結(jié)束后，將各組試管離心（例如800-1000g，5分鐘），使未破裂的紅細(xì)胞沉淀。
6. 吸光度測定： 小心吸取各管上清液，用分光光度計(jì)在選定波長（如540nm或545nm）測定吸光度（OD值）。用空白對(duì)照組（生理鹽水+稀釋血液離心后的上清液）調(diào)零。

五、 結(jié)果計(jì)算與判定

1. 計(jì)算溶血率：

2. 結(jié)果判定（參考ISO 10993-5原則）：
* 若計(jì)算得出的溶血率小于5%，通常認(rèn)為該止血海綿樣品無溶血性，符合生物學(xué)安全性的基本要求。
* 若溶血率大于或等于5%，則判定該止血海綿樣品具有溶血性。此時(shí)需結(jié)合產(chǎn)品的設(shè)計(jì)、材料、臨床接觸方式等因素進(jìn)行綜合分析，判斷風(fēng)險(xiǎn)是否可接受，或需要進(jìn)一步研究（如改進(jìn)材料、工藝、重復(fù)試驗(yàn)、進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)等）。

六、 試驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)與注意事項(xiàng)

• 血液質(zhì)量： 使用新鮮、健康的抗凝血至關(guān)重要。血液存放時(shí)間過長或處理不當(dāng)會(huì)影響結(jié)果。
• 無菌操作： 盡可能在無菌或潔凈條件下操作，避免微生物污染干擾。
• 溫度與時(shí)間控制： 孵育溫度和時(shí)間的嚴(yán)格控制對(duì)結(jié)果重現(xiàn)性非常重要。
• 樣品制備： 浸提條件（溫度、時(shí)間、比例）的選擇應(yīng)能充分反映材料潛在的溶出物。
• 對(duì)照設(shè)置： 陰性對(duì)照和陽性對(duì)照必須有效且結(jié)果符合預(yù)期（陰性對(duì)照接近0%，陽性對(duì)照接近100%溶血），否則試驗(yàn)無效。
• 平行樣： 設(shè)置平行樣以減少誤差。
• 離心條件： 確保離心力足夠沉淀未溶血的紅細(xì)胞，但又不會(huì)引起額外的機(jī)械性溶血。

七、 意義與局限性

• 意義：
  • 初步篩選： 快速、相對(duì)經(jīng)濟(jì)地篩選止血海綿材料或其溶出物對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞作用。
  • 安全性指標(biāo)： 是評(píng)價(jià)醫(yī)療器械血液相容性的核心指標(biāo)之一，直接關(guān)系到臨床應(yīng)用的安全性。
  • 質(zhì)量控制： 作為產(chǎn)品放行或工藝變更后的重要生物安全性檢測項(xiàng)目。
• 局限性：
  • 體外模擬： 體外環(huán)境無法完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的血液流動(dòng)、細(xì)胞相互作用、代謝清除等過程。
  • 單一指標(biāo)： 僅評(píng)價(jià)對(duì)紅細(xì)胞的急性損傷，不反映對(duì)血小板、白細(xì)胞或凝血系統(tǒng)的影響。
  • 材料與血液比例： 試驗(yàn)中設(shè)定的材料表面積/質(zhì)量與血液體積的比例可能無法精確對(duì)應(yīng)實(shí)際臨床接觸情況。

結(jié)論

止血海綿溶血試驗(yàn)是評(píng)估其生物相容性，特別是血液相容性的基礎(chǔ)性、強(qiáng)制性測試。通過標(biāo)準(zhǔn)化的方法定量檢測材料引起紅細(xì)胞溶解的程度，為判斷產(chǎn)品是否具有溶血風(fēng)險(xiǎn)提供關(guān)鍵科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果（溶血率是否小于5%）是評(píng)價(jià)止血海綿能否安全接觸血液的重要門檻。然而，該結(jié)果需結(jié)合其他生物相容性試驗(yàn)（如細(xì)胞毒性、致敏性、刺激或皮內(nèi)反應(yīng)、凝血試驗(yàn)、補(bǔ)體激活試驗(yàn)等）以及產(chǎn)品的整體設(shè)計(jì)、預(yù)期用途和臨床前/臨床數(shù)據(jù)，才能對(duì)其生物安全性做出全面、客觀的評(píng)價(jià)。嚴(yán)格遵守國際國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和判定，是保證試驗(yàn)結(jié)果可靠性和可比性的關(guān)鍵。