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PCR檢測

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發(fā)布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-07-24 22:11:13

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

PCR檢測的重要性和背景介紹

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)檢測作為現(xiàn)代分子生物學(xué)最核心的技術(shù)之一，已成為疾病診斷、法醫(yī)鑒定、食品安全監(jiān)控和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域不可或缺的檢測手段。該技術(shù)由Kary Mullis于1983年發(fā)明，其通過模擬DNA自然過程，能夠在數(shù)小時內(nèi)將特定DNA片段擴增數(shù)百萬倍，實現(xiàn)微量核酸樣本的高靈敏度檢測。在臨床醫(yī)學(xué)中，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測（如新冠病毒、HIV、HBV等）、遺傳病篩查和腫瘤基因突變分析；在科研領(lǐng)域，它是基因表達分析、基因克隆和測序的重要工具；在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，PCR檢測為食源性致病菌監(jiān)測、轉(zhuǎn)基因成分鑒定等提供了可靠的技術(shù)支持。隨著實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR等新技術(shù)的涌現(xiàn)，PCR檢測的準(zhǔn)確性、特異性和應(yīng)用范圍得到持續(xù)拓展。

檢測項目和范圍

PCR檢測主要針對以下項目：1)病原微生物核酸檢測（包括細菌、病毒、真菌等）；2)遺傳性疾病相關(guān)基因突變；3)腫瘤標(biāo)志物及用藥指導(dǎo)基因；4)轉(zhuǎn)基因生物成分；5)法醫(yī)DNA鑒定。檢測樣本類型涵蓋血液、組織、唾液、尿液、環(huán)境拭子等多種生物材料。根據(jù)檢測目的不同，可分為定性PCR（檢測特定序列是否存在）、定量PCR（測定目標(biāo)DNA拷貝數(shù)）和突變檢測PCR（識別特定基因變異）。近年來，多重PCR技術(shù)可同時檢測多個靶標(biāo)，顯著提高了檢測效率。

使用的檢測儀器和設(shè)備

PCR檢測系統(tǒng)主要包括：1)熱循環(huán)儀（PCR儀）：提供精確的溫度循環(huán)控制，主流型號包括ABI 7500、Bio-Rad CFX96等；2)核酸提取設(shè)備：如MagNA Pure、QIAcube等自動化提取系統(tǒng)；3)電泳系統(tǒng)：用于常規(guī)PCR產(chǎn)物分析；4)實時熒光PCR儀：如ABI QuantStudio系列，可實時監(jiān)測擴增過程；5)超微量分光光度計或熒光計（如NanoDrop）用于核酸濃度測定。輔助設(shè)備包括生物安全柜、離心機、超純水系統(tǒng)等。數(shù)字PCR系統(tǒng)如Bio-Rad QX200可提供絕對定量檢測。實驗室還需配備-20℃和-80℃冰箱用于試劑和樣本保存。

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法和流程

標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測流程包括：1)樣本采集與處理：按規(guī)范采集樣本并立即處理或低溫保存；2)核酸提?。菏褂蒙唐坊噭┖谢蜃詣踊崛x獲取高質(zhì)量核酸；3)反應(yīng)體系配制：包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、緩沖液等，嚴格防止污染；4)PCR擴增：設(shè)置預(yù)變性（95℃ 2-5min）、變性（95℃ 15-30s）、退火（溫度依引物而定，30-60s）、延伸（72℃ 30-60s/kb）等步驟，循環(huán)30-40次；5)產(chǎn)物分析：實時熒光PCR可直接讀取結(jié)果，常規(guī)PCR需通過電泳或測序驗證。對于臨床診斷，需設(shè)立陽性對照、陰性對照和內(nèi)部質(zhì)控，全程遵循質(zhì)量保證程序。

檢測結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn)

PCR檢測結(jié)果判讀需綜合考慮：1)擴增曲線：實時PCR應(yīng)有典型的S形曲線，Ct值≤40（視試劑盒而定）；2)溶解曲線：單一峰表明擴增特異性好；3)電泳條帶：大小與預(yù)期相符且無非特異性條帶；4)質(zhì)控樣本：陽性對照應(yīng)檢出，陰性對照和無模板對照應(yīng)無擴增。定量檢測需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.98方可用于計算拷貝數(shù)。臨床報告應(yīng)注明檢測方法、檢出限和結(jié)果解釋，如"新冠病毒ORF1ab基因和N基因檢測陽性（Ct值分別為28.5和30.2）"?？梢山Y(jié)果需重復(fù)檢測或采用其他方法驗證。實驗室應(yīng)定期參加CAP、EMQN等外部質(zhì)評以保證結(jié)果可靠性。