您現(xiàn)在的位置：首頁 > 檢測項目 > 其他檢測

微生物、內(nèi)毒素及生物負(fù)載檢測

1對1客服專屬服務(wù)，免費制定檢測方案，15分鐘極速響應(yīng)

可選形式：電子報告紙質(zhì)報告

可選語言：中文報告英文報告

發(fā)布時間：2025-03-13 10:53:43 更新時間：2025-03-12 10:53:53

點擊：0

作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

微生物、內(nèi)毒素及生物負(fù)載檢測是生物制藥、醫(yī)療器械及無菌產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，需圍繞 污染控制、滅菌驗證及生物安全性 等核心目標(biāo)展開。以下是基于 USP <61>/<85>（美國藥典）、ISO 11737（醫(yī)療器械滅菌微生物方法） 及 ISO 10993-12（醫(yī)療器械生物學(xué)評價） 的系統(tǒng)化檢測方案：

一、核心檢測項目與標(biāo)準(zhǔn)

檢測類別	關(guān)鍵參數(shù)	檢測方法	判定標(biāo)準(zhǔn)
微生物限度	需氧菌總數(shù)（TAMC）、霉菌酵母菌總數(shù)（TYMC）	膜過濾法/平皿法（USP <61>）	USP <61>（注射劑：TAMC≤10 CFU/100mL）
內(nèi)毒素檢測	細菌內(nèi)毒素限值（LAL法，EU/kg）	鱟試劑動態(tài)顯色法（USP <85>）	注射劑≤20 EU/kg（USP <85>）
生物負(fù)載	滅菌前微生物總數(shù)（需氧/厭氧）	直接接種法（ISO 11737-1）	ISO 11737-1（根據(jù)滅菌工藝驗證）
特定致病菌	金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等	PCR/選擇性培養(yǎng)基（USP <62>）	不得檢出（無菌產(chǎn)品）
無菌檢查	無菌保證水平（SAL≤10??）	薄膜過濾法（ISO 11737-2）	ISO 11135（EO滅菌驗證）
熱原檢測	家兔法替代驗證（與LAL法相關(guān)性）	家兔體溫監(jiān)測（USP <151>）	體溫上升≤0.5℃（陰性）

二、檢測設(shè)備與工具

設(shè)備/工具	用途	推薦型號/品牌
微生物培養(yǎng)箱	需氧/厭氧菌培養(yǎng)（30~35℃）	Thermo Scientific Heratherm
鱟試劑檢測儀	內(nèi)毒素定量（動態(tài)顯色法/濁度法）	Charles River Endosafe Nexgen
PCR儀	致病菌快速鑒定（16S rRNA基因擴增）	Bio-Rad CFX96（實時熒光定量）
無菌隔離器	無菌檢查樣品處理（A級環(huán)境）	Bosch SGV-800（HEPA過濾）
生物負(fù)載回收裝置	微生物洗脫與計數(shù)（超聲+膜過濾）	Sartorius Stedim Biotech

三、標(biāo)準(zhǔn)化檢測流程

1. 微生物限度檢測（USP <61>）

樣品處理：
- 液體樣品：直接膜過濾（孔徑0.45μm），沖洗液為pH 7.2 PBS；
- 固體樣品：均質(zhì)后稀釋（1:10~1:1000），取1mL接種TSA/SDA培養(yǎng)基。
培養(yǎng)與計數(shù)：
- 需氧菌：30~~35℃×3~~5天（TSA）；
- 霉菌/酵母菌：20~~25℃×5~~7天（SDA）。

2. 內(nèi)毒素檢測（動態(tài)顯色法）

樣品制備：
- 稀釋樣品至無干擾濃度（通常1:10~1:100），驗證無抑制/增強效應(yīng)（PFE 50%~200%）；
反應(yīng)檢測：
- 加入鱟試劑（LAL）與顯色底物，37℃孵育，檢測吸光度變化（波長405nm）；
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.005~50 EU/mL，計算樣品內(nèi)毒素濃度。

3. 生物負(fù)載檢測（ISO 11737-1）

微生物洗脫：
- 超聲處理（40kHz×30min）或震蕩洗脫（含中和劑的PBS）；
回收率驗證：
- 接種已知濃度菌懸液（如枯草芽孢桿菌ATCC 6633），計算回收率（≥50%為有效）；
計數(shù)與報告：
- 膜過濾后培養(yǎng)，統(tǒng)計CFU/單位產(chǎn)品（如CFU/器械）。

4. 無菌檢查（薄膜過濾法）

樣品處理：
- 液體直接過濾，固體溶解/浸提后過濾（孔徑0.45μm）；
培養(yǎng)基培養(yǎng)：
- 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（厭氧菌，30~35℃×14天）；
- 大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基（需氧菌，20~25℃×14天）。

四、驗證與干擾排除

驗證類型	目標(biāo)	方法
方法適用性驗證	確認(rèn)檢測方法無抑制/促進微生物生長	接種已知菌（如銅綠假單胞菌ATCC 9027），回收率≥70%
內(nèi)毒素干擾試驗	排除樣品對LAL反應(yīng)的干擾	標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素添加回收（50%~200%）
生物負(fù)載回收率	確保洗脫效率符合要求	比較物理洗脫與化學(xué)中和效果

五、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	改進措施
內(nèi)毒素檢測假陽性	樣品含β-葡聚糖或金屬離子干擾	預(yù)處理（稀釋/螯合劑EDTA），改用特異性鱟試劑（重組C因子法）
生物負(fù)載回收率低	微生物吸附在器械表面難以洗脫	優(yōu)化超聲參數(shù)（頻率/時間），添加表面活性劑（如吐溫80）
無菌檢查假陰性	抗生素殘留抑制微生物生長	充分中和抗生素（如青霉素酶處理），驗證中和有效性
微生物限度超標(biāo)	生產(chǎn)環(huán)境微生物污染	加強潔凈室監(jiān)控（ISO 14644），優(yōu)化清潔消毒程序

六、合規(guī)報告與認(rèn)證

報告內(nèi)容：
- 檢測方法（USP/ISO標(biāo)準(zhǔn)）、樣品信息（批次/來源）、結(jié)果數(shù)據(jù)（CFU/EU值）；
- 驗證結(jié)論（方法適用性、干擾排除）、合規(guī)性聲明（如“符合ISO 11737 SAL 10??”）。
認(rèn)證路徑：
- 藥品生產(chǎn)：USP/EP/JP藥典標(biāo)準(zhǔn) + FDA cGMP；
- 醫(yī)療器械：ISO 13485質(zhì)量管理體系 + FDA 510(k)/CE MDR；
- 實驗室資質(zhì)：ISO/IEC 17025認(rèn)可 + GLP規(guī)范。

通過系統(tǒng)化檢測與驗證，可確保產(chǎn)品在微生物安全性與內(nèi)毒素控制上符合法規(guī)要求。建議結(jié)合 快速微生物檢測技術(shù)（如ATP生物發(fā)光法）縮短放行周期，并對高風(fēng)險工藝（如凍干制劑）實施 實時環(huán)境監(jiān)測（粒子計數(shù)+浮游菌采樣）。對于生物負(fù)載數(shù)據(jù)，需與滅菌工藝驗證（如VDmax法）聯(lián)動分析，確保滅菌有效性。