藍耳病（豬繁殖與呼吸綜合征，PRRS）的毒株檢測是豬場疫病防控的核心環(huán)節(jié)，旨在快速確診感染、區(qū)分毒株類型（如高致病性毒株HP-PRRSV、經(jīng)典毒株等），并指導疫苗選擇與生物安全管理。以下是系統(tǒng)化的檢測方案與操作指南：
一、檢測目標與意義
- 毒株分型：
- 基因型：區(qū)分歐洲型（Type 1）與北美型（Type 2）。
- 毒力差異：高致病性毒株（如中國JXA1、美國VR-2332）與低致病性毒株。
- 應用場景：
- 疫情暴發(fā)溯源、疫苗匹配性評估、引種前檢疫、凈化監(jiān)測。
二、樣本采集與處理
| 樣本類型 |
采集方法 |
保存與運輸 |
| 血清 |
頸靜脈/前腔靜脈采血（5~10mL），離心取血清 |
2~8℃冷藏（24h內(nèi)送檢）或-20℃凍存 |
| 組織（肺、淋巴結(jié)） |
無菌采集病變組織（1~2g） |
置于含抗生素的PBS緩沖液，冰袋運輸 |
| 口腔液 |
棉繩懸掛30分鐘，收集唾液混合液 |
加入RNA保護劑，-20℃保存 |
| 精液 |
采集公豬精液（≥1mL） |
低溫避光保存，4h內(nèi)檢測 |
三、檢測方法與技術
1. 病原學檢測（病毒存在確認）
| 方法 |
原理 |
特點 |
檢測限（靈敏度） |
| RT-PCR |
擴增病毒ORF5/ORF7基因片段 |
快速、特異性高，區(qū)分基因型 |
10²~10³ copies/μL |
| 實時熒光定量RT-qPCR |
定量檢測病毒核酸（N基因） |
高靈敏度，可判斷病毒載量 |
10¹~10² copies/μL |
| 病毒分離 |
接種Marc-145細胞，觀察CPE（細胞病變效應） |
金標準，耗時長（3~7天） |
活病毒≥10² TCID50/mL |
| 抗原ELISA |
檢測病毒蛋白（如N蛋白） |
快速篩查，但靈敏度低于PCR |
≥10? copies/μL |
2. 血清學檢測（抗體監(jiān)測）
| 方法 |
靶標 |
用途 |
| ELISA（IgG/IgM） |
檢測血清中抗PRRSV抗體 |
群體免疫評估、感染動態(tài)監(jiān)測 |
| 中和試驗（SNT） |
測定中和抗體效價（抑制病毒侵染） |
疫苗效力評價、交叉保護分析 |
3. 基因測序與進化分析
- 靶基因：ORF5（主要中和表位區(qū)，變異率高）。
- 步驟：
- PCR擴增ORF5基因并純化產(chǎn)物。
- Sanger測序或高通量測序（NGS）。
- 構(gòu)建進化樹（MEGA軟件），分析毒株與疫苗株（如Ingelvac PRRS MLV）的親緣關系。
四、檢測流程（以RT-qPCR為例）
- RNA提取：
- 使用TRIzol或商業(yè)試劑盒（如Qiagen RNeasy）提取病毒RNA。
- 反轉(zhuǎn)錄：
- qPCR擴增：
- 引物/探針（示例）：
- 正向引物：5'-CGGTATGGCAGCTGCTTG-3'
- 反向引物：5'-CACCTGCTCCACTGGTTGTT-3'
- 探針：FAM-5'-TGCAGCAGCAGTTGGAATAGCA-3'-BHQ1
- 反應條件：95℃ 3min → 40 cycles（95℃ 15s → 60℃ 30s）。
- 結(jié)果判讀：
- Ct值≤35：強陽性（高病毒載量）；35<Ct≤40：弱陽性（需復測）；Ct>40：陰性。
五、毒株分型與報告解讀
| 檢測結(jié)果 |
臨床意義 |
防控建議 |
| HP-PRRSV（ORF5變異株） |
高致死率（母豬流產(chǎn)、仔豬呼吸困難） |
緊急隔離，接種匹配疫苗（如JXA1-R株） |
| 經(jīng)典毒株（低致病性） |
亞臨床感染或輕微呼吸道癥狀 |
加強生物安全，監(jiān)測抗體動態(tài) |
| 疫苗株檢出（如MLV） |
疫苗免疫后排毒 |
區(qū)分野毒與疫苗毒（需測序確認） |
六、注意事項與質(zhì)控
- 避免交叉污染：
- 分區(qū)操作（樣本處理、PCR擴增、產(chǎn)物分析），使用UNG酶防殘留污染。
- 樣本質(zhì)量控制：
- 添加內(nèi)參基因（如β-actin）排除RNA降解。
- 疫苗干擾：
- 活疫苗（MLV）免疫后2周內(nèi)可能檢出病毒核酸，需結(jié)合臨床癥狀判斷。
七、參考標準與認證
- 國際標準：OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》第PRRS章節(jié)。
- 國內(nèi)標準：GB/T 35911-2018《豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法》。
- 實驗室認證：檢測需在生物安全二級（BSL-2）實驗室進行，通過CNAS/CMA認證。
通過精準的藍耳毒株檢測，可有效指導豬場制定個性化防控策略，降低經(jīng)濟損失。建議結(jié)合定期監(jiān)測與全基因組測序，跟蹤病毒變異趨勢，優(yōu)化疫苗與生物安全方案。
CMA認證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認可
實驗室認可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認證
質(zhì)量管理體系認證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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