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鼠傷寒沙門(mén)式菌回復(fù)突變檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-10 18:37:29 更新時(shí)間：2025-08-09 18:37:29

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）回復(fù)突變檢測(cè)，也稱為Ames試驗(yàn)（Ames Test），是一種廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)和遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)典方法。該方法由Bruce Ames教授在1970年代開(kāi)發(fā)，主要用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)、藥物、食品添加劑和環(huán)境污染物等的致突變性（mutagenicity）。其核心原理是利用鼠傷寒沙門(mén)氏菌的特定突變菌株（如TA98、TA100等），這些菌株在組氨酸（histidine）合成途徑中發(fā)生突變，導(dǎo)致其無(wú)法在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。當(dāng)樣品中存在致突變物時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生回復(fù)突變（reverse mutation），使菌株恢復(fù)合成組氨酸的能力，從而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上形成可見(jiàn)的菌落。通過(guò)計(jì)數(shù)這些菌落數(shù)量，可以定量分析樣品的致突變潛力。該檢測(cè)因其簡(jiǎn)便性、快速性（通常24-48小時(shí)完成）和高靈敏度而被全球多個(gè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)采納，廣泛應(yīng)用于食品安全評(píng)估、藥品開(kāi)發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及化妝品安全性測(cè)試等領(lǐng)域?；貜?fù)突變檢測(cè)不僅幫助識(shí)別潛在致癌物，還推動(dòng)了工業(yè)生產(chǎn)的綠色化進(jìn)程，是預(yù)防人類健康風(fēng)險(xiǎn)的重要工具。

檢測(cè)項(xiàng)目

鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變檢測(cè)的核心項(xiàng)目包括多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。首先，是回復(fù)突變頻率（Reverse Mutation Frequency），即每單位菌體或每單位濃度的樣品在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)，該指標(biāo)直接反映致突變性的強(qiáng)度。其次，是菌株存活率（Survival Rate），用于評(píng)估樣品對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞毒性；這通過(guò)比較處理組和空白對(duì)照組在富含組氨酸培養(yǎng)基上的菌落數(shù)來(lái)計(jì)算。第三個(gè)項(xiàng)目是劑量-反應(yīng)關(guān)系（Dose-Response Relationship），在不同濃度樣品下測(cè)試突變頻率的變化，以判斷致突變性的閾值和線性趨勢(shì)。此外，還包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的驗(yàn)證項(xiàng)目，陽(yáng)性對(duì)照通常使用已知致突變物如2-氨基蒽（2-AA）或疊氮鈉（sodium azide），陰性對(duì)照則使用溶劑（如DMSO或蒸餾水），以確保檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性和準(zhǔn)確性?？傮w而言，這些項(xiàng)目共同構(gòu)成一個(gè)完整的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估框架，幫助研究人員量化并解釋樣品的遺傳毒性潛力。

檢測(cè)儀器

鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變檢測(cè)需要使用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室儀器，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和精確性。主要儀器包括培養(yǎng)設(shè)備，如恒溫培養(yǎng)箱（通常設(shè)置在37°C，模擬人體溫度），用于細(xì)菌的培養(yǎng)和突變表達(dá)階段；以及生物安全柜或無(wú)菌操作臺(tái)，提供無(wú)菌環(huán)境以防止污染。樣品處理儀器方面，離心機(jī)（用于細(xì)菌沉淀和樣品分離）、漩渦混合器（用于均勻混勻樣品和細(xì)菌懸浮液）以及分光光度計(jì)（用于測(cè)量細(xì)菌密度，如OD600值）是必不可少的。檢測(cè)階段的關(guān)鍵儀器是微生物培養(yǎng)皿（Petri dishes）和計(jì)數(shù)設(shè)備，如菌落計(jì)數(shù)器或自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，用于精確計(jì)數(shù)回復(fù)突變形成的菌落。輔助儀器還包括移液器（micropipettes，用于精準(zhǔn)加樣）、振蕩培養(yǎng)器（用于液體培養(yǎng)中的細(xì)菌生長(zhǎng)）和顯微鏡（用于初步觀察細(xì)菌形態(tài)）。所有儀器需定期校準(zhǔn)和維護(hù)，以符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（如ISO 17025）的要求，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可比性。

檢測(cè)方法

鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法遵循逐步的實(shí)驗(yàn)流程，主要基于Ames試驗(yàn)的經(jīng)典方案。首先，是菌株準(zhǔn)備階段：使用冷凍保存的特定菌株（如TA98或TA100），在富含組氨酸的肉湯中進(jìn)行活化培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng)16-24小時(shí)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。其次，樣品處理：將測(cè)試樣品（溶解于適當(dāng)溶劑）與細(xì)菌懸浮液混合，并加入S9混合物（模擬哺乳動(dòng)物肝代謝系統(tǒng)，以檢測(cè)需代謝激活的致突變物），在37°C孵育20-90分鐘。接著，是突變表達(dá)階段：將混合液加入頂層軟瓊脂（含少量組氨酸和生物素），并鋪在缺乏組氨酸的底層瓊脂平板上。最后，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：平板在37°C培養(yǎng)48小時(shí)，統(tǒng)計(jì)形成的回復(fù)突變菌落數(shù)。整個(gè)方法強(qiáng)調(diào)平行實(shí)驗(yàn)（如設(shè)置3個(gè)重復(fù)）和對(duì)照組（陰性對(duì)照為溶劑，陽(yáng)性對(duì)照為已知致突變物）。數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算突變頻率（處理組菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)）來(lái)分析，如果頻率超過(guò)陰性對(duì)照的2倍以上且呈劑量依賴性，則判斷為陽(yáng)性結(jié)果。該方法需在GLP（良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范）下進(jìn)行，以確?？芍貜?fù)性。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變檢測(cè)需嚴(yán)格遵守國(guó)際和國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范，以確保檢測(cè)結(jié)果的全球認(rèn)可性。主要標(biāo)準(zhǔn)包括經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）的Guideline 471，該指南詳細(xì)規(guī)定了菌株選擇、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)報(bào)告和質(zhì)量控制要求，例如必須使用已驗(yàn)證的菌株（如TA1535或TA100）并執(zhí)行陽(yáng)性/陰性對(duì)照測(cè)試。另一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是ISO 16240:2007，它補(bǔ)充了環(huán)境樣品測(cè)試的特殊注意事項(xiàng)。此外，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）的OPPTS 870.5100和歐盟的EU B.13/14指南也提供了類似的框架，涵蓋S9混合物的制備和驗(yàn)證程序。這些標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)關(guān)鍵質(zhì)量控制點(diǎn)：菌株的遺傳特性驗(yàn)證（如通過(guò)自發(fā)突變測(cè)試）、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（應(yīng)小于20%）、以及數(shù)據(jù)解釋的基準(zhǔn)（如突變頻率的顯著性閾值）。在中國(guó)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)如GB/T 21794-2008（化學(xué)品遺傳毒性檢測(cè)方法）也整合了這些元素。檢測(cè)報(bào)告必須包括樣品信息、方法細(xì)節(jié)、原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析，以支持監(jiān)管審批和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。通過(guò)遵循這些標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果可在全球范圍內(nèi)用于產(chǎn)品安全和環(huán)境合規(guī)性評(píng)估。