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內(nèi)皮刺激檢測

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發(fā)布時間：2025-08-10 16:13:01 更新時間：2025-08-09 16:13:01

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

內(nèi)皮刺激檢測概述

內(nèi)皮刺激檢測是生物相容性評價中的一項關(guān)鍵測試，主要用于評估醫(yī)療器械、生物材料、藥物制劑或其浸提液對血管內(nèi)皮細胞的潛在刺激性和損傷作用。血管內(nèi)皮作為血管內(nèi)壁的單層細胞，在維持血管張力、血液流動性、炎癥反應(yīng)、凝血與抗凝平衡以及物質(zhì)交換等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的生理功能。當(dāng)醫(yī)療器械（如血管支架、導(dǎo)管、人工血管、透析膜等）或藥物長期或反復(fù)接觸血管內(nèi)皮時，可能引起內(nèi)皮細胞的物理損傷、激活炎癥通路、誘導(dǎo)凋亡或功能紊亂，進而導(dǎo)致血栓形成、內(nèi)膜增生、血管痙攣等一系列不良臨床后果。因此，在相關(guān)產(chǎn)品進入臨床應(yīng)用或市場前，進行嚴(yán)謹?shù)膬?nèi)皮刺激檢測對于評估其使用的安全性和預(yù)測潛在的生物相容性風(fēng)險至關(guān)重要。該檢測為產(chǎn)品設(shè)計優(yōu)化、材料篩選和最終的安全性評價提供了不可或缺的科學(xué)依據(jù)。

主要檢測項目

內(nèi)皮刺激檢測通常圍繞以下幾個方面展開評估：

1. 細胞形態(tài)學(xué)觀察： 通過顯微鏡（光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡、電子顯微鏡）觀察內(nèi)皮細胞在接觸受試物后的形態(tài)變化，如皺縮、腫脹、脫落、空泡化、細胞間隙增大等，這是最直觀的損傷指標(biāo)。

2. 細胞活力/毒性檢測： 使用特定染料或試劑（如臺盼藍、MTT、CCK-8、LDH釋放試驗）定量評估內(nèi)皮細胞在受試物作用后的存活率或死亡率。

3. 炎癥因子/粘附分子表達： 檢測內(nèi)皮細胞在受試物刺激下釋放關(guān)鍵炎癥因子（如IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α）和表達粘附分子（如ICAM-1, VCAM-1, E-selectin）的水平，反映其炎癥激活狀態(tài)。

4. 功能學(xué)檢測： 評估內(nèi)皮細胞屏障功能（如跨內(nèi)皮細胞電阻TEER測量、熒光標(biāo)記白蛋白或葡聚糖的通透性試驗）、抗凝/促凝功能（如組織因子TF、血栓調(diào)節(jié)蛋白TM、前列環(huán)素PGI2、一氧化氮NO的檢測）、遷移能力（劃痕愈合試驗）以及血管生成潛能（管腔形成試驗）等是否受到不良影響。

5. 凋亡/壞死檢測： 通過Annexin V/PI雙染、TUNEL法、Caspase活性檢測等評估受試物是否誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞發(fā)生程序性死亡（凋亡）或壞死。

常用檢測儀器

進行內(nèi)皮刺激檢測需要依賴多種精密儀器：

1. 細胞培養(yǎng)相關(guān)： CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、離心機、液氮罐（細胞凍存）、水浴鍋/金屬浴（解凍）、移液器等。

2. 形態(tài)觀察與成像： 倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡（用于高分辨率成像和定位）、掃描電子顯微鏡SEM（觀察超微結(jié)構(gòu)）、透射電子顯微鏡TEM（觀察細胞器變化）。

3. 定量分析： * 酶標(biāo)儀： 用于讀取MTT、CCK-8、LDH、ELISA（檢測細胞因子/蛋白表達）等試驗的吸光度值（OD值），進行定量分析。 * 流式細胞儀： 用于快速、高通量地分析細胞凋亡/壞死（Annexin V/PI）、細胞表面粘附分子表達、細胞周期、細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平等。 * 實時熒光定量PCR儀： 用于檢測炎癥因子、粘附分子、功能相關(guān)基因的mRNA表達水平。 * Western blot 系統(tǒng)： 包括電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、成像系統(tǒng)（如化學(xué)發(fā)光成像儀），用于檢測特定蛋白的表達量及其磷酸化等修飾狀態(tài)。

4. 功能檢測專用設(shè)備： * 跨內(nèi)皮電阻儀 (TEER Meter)： 專門用于測量內(nèi)皮細胞單層（通常培養(yǎng)在Transwell小室上）的電阻值，評估屏障完整性。 * 血管張力測定儀： 主要用于離體血管環(huán)實驗，評估受試物對血管內(nèi)皮依賴/非依賴性舒縮功能的影響（常在藥理學(xué)研究中結(jié)合使用）。 * 微流控芯片系統(tǒng)/模擬血管裝置： 更先進的設(shè)備，能模擬體內(nèi)血流剪切應(yīng)力環(huán)境，在更生理相關(guān)的條件下評估內(nèi)皮細胞反應(yīng)。

主要檢測方法

內(nèi)皮刺激檢測方法多樣，需根據(jù)研究目的和受試物特性選擇：

1. 體外細胞模型法： 這是最常用、經(jīng)濟且可高通量篩選的方法。 * 細胞系：常使用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）、人主動脈內(nèi)皮細胞（HAEC）、人微血管內(nèi)皮細胞（HMEC）、Eahy926（融合細胞系）等。將細胞接種于培養(yǎng)板、Transwell小室或特殊涂層表面，加入受試物（直接接觸或浸提液）培養(yǎng)特定時間后，進行上述各項指標(biāo)的檢測。 * 原代細胞：分離自人或動物組織的原代內(nèi)皮細胞（如HUVEC），其生物學(xué)特性更接近體內(nèi)狀態(tài)，但操作復(fù)雜、個體差異大、傳代次數(shù)有限。 * 3D培養(yǎng)/類器官：更先進的方法，如內(nèi)皮細胞球體、與平滑肌細胞/成纖維細胞共培養(yǎng)、或使用生物材料支架構(gòu)建的更復(fù)雜三維模型，能更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境。

2. 離體血管環(huán)/血管段實驗： 將動物（如大鼠、兔、豬）或人來源的血管（動脈為主）制成血管環(huán)或血管段，置于器官浴槽中，給予受試物或浸提液刺激，通過張力傳感器測量血管收縮/舒張反應(yīng)，評估內(nèi)皮功能（如乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)是否受損）。

3. 體內(nèi)動物實驗： 在更高層面上評估整體效應(yīng)。 * 血管置入模型：在大鼠、兔、豬或犬等動物體內(nèi)置入血管支架、導(dǎo)管等器械，一段時間后取出血管組織，進行組織病理學(xué)檢查（HE染色、免疫組化評估內(nèi)皮覆蓋、炎癥浸潤、內(nèi)膜增生等）。 * 靜脈注射/局部灌注模型：將受試物（如藥物溶液）直接注射到動物血管內(nèi)或局部灌注，觀察急性或慢性反應(yīng)（如血管通透性變化、血栓形成傾向、炎癥因子水平升高）。

遵循的檢測標(biāo)準(zhǔn)

內(nèi)皮刺激檢測的實施需嚴(yán)格遵循國際、國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，確保結(jié)果的可靠性、可比性和可接受性：

1. ISO 10993 系列標(biāo)準(zhǔn) (醫(yī)療器械生物學(xué)評價)： 這是全球普遍認可的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)。 * ISO 10993-1: 風(fēng)險管理過程中的評價與試驗 - 概述了生物學(xué)評價的基本原則和流程，確定需要進行內(nèi)皮相容性評估的情形（如與循環(huán)血液長期或持久接觸的器械）。 * ISO 10993-4: 與血液相互作用試驗選擇 - 這是直接相關(guān)的核心標(biāo)準(zhǔn)。它規(guī)定了評估醫(yī)療器械血液相容性的試驗方法選擇策略，明確將“血栓形成”、“凝血”、“血小板”、“血液學(xué)”和“補體系統(tǒng)”等項目（這些項目均與血管內(nèi)皮細胞的激活和功能密切相關(guān)）作為關(guān)鍵評價終點。雖然它沒有規(guī)定單一的內(nèi)皮細胞試驗，但它要求根據(jù)器械接觸性質(zhì)和持續(xù)時間，選擇適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi)方法評估上述終點，內(nèi)皮細胞試驗是評估這些終點的重要手段（尤其對于血栓形成和凝血機制）。 * ISO 10993-5: 體外細胞毒性試驗 - 內(nèi)皮刺激檢測中的細胞毒性部分（如MTT, LDH）需要符合此標(biāo)準(zhǔn)要求。 * ISO 10993-6: 植入后局部反應(yīng)試驗 - 對于血管內(nèi)植入物，組織病理學(xué)檢查需參照此標(biāo)準(zhǔn)，其中內(nèi)皮層的變化（如內(nèi)皮剝脫、內(nèi)皮增生、內(nèi)皮完整性）是重要的觀察指標(biāo)。 * ISO 10993-12: 樣品制備與參照樣品 - 規(guī)定受試物（器械浸提液）的制備方法（浸提介質(zhì)、比例、條件、時間）。

2. ASTM 國際標(biāo)準(zhǔn)： * ASTM F756: 評估材料溶血性能的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 - 溶血與內(nèi)皮損傷和血栓形成有關(guān)聯(lián)。 * ASTM F2150: 用于血管假體生物相容性測試的動物植入試驗標(biāo)準(zhǔn)指南 - 包含對血管內(nèi)皮愈合和反應(yīng)的評估要求。 * 其他特定方法的標(biāo)準(zhǔn)（如特定細胞培養(yǎng)、功能檢測方法）也可能被參考。

3. 國家藥典/監(jiān)管機構(gòu)指南：