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體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)）檢測

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發(fā)布時間：2025-08-10 10:21:15 更新時間：2025-08-09 10:21:16

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)）檢測

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)概述

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下評估材料、化學(xué)品或藥物對細(xì)胞生存和功能影響的標(biāo)準(zhǔn)化方法，廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、醫(yī)療器械安全評估、化妝品測試和環(huán)境毒理學(xué)研究。這種試驗(yàn)通過模擬體內(nèi)環(huán)境，提供快速、經(jīng)濟(jì)且可重復(fù)的結(jié)果，有助于早期篩選潛在毒性物質(zhì)，從而減少動物實(shí)驗(yàn)的需求。其中，MTT試驗(yàn)（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物試驗(yàn)）和LDH試驗(yàn)（乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)）是兩種核心方法。MTT試驗(yàn)側(cè)重于檢測細(xì)胞代謝活性，通過測量線粒體脫氫酶活性來評估細(xì)胞活力；而LDH試驗(yàn)則關(guān)注細(xì)胞膜完整性，通過量化乳酸脫氫酶釋放來指示細(xì)胞損傷程度。這兩種試驗(yàn)互補(bǔ)性強(qiáng)，MTT能反映長期細(xì)胞增殖狀態(tài)，LDH則更適合急性毒性檢測。它們通常在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行，如使用人源細(xì)胞系（如HEK293或HeLa細(xì)胞），并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以確保結(jié)果的可靠性和可比性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，這些試驗(yàn)已成為全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如FDA和EMA）推薦的標(biāo)準(zhǔn)程序，在保障產(chǎn)品安全方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

檢測項(xiàng)目

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的核心檢測項(xiàng)目包括MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)各自針對不同的細(xì)胞毒性指標(biāo)。MTT試驗(yàn)主要檢測細(xì)胞代謝活性，通過量化MTT試劑被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原生成的甲臜結(jié)晶，反映細(xì)胞活力水平；該結(jié)果通常以吸光度值表示，數(shù)值越高表示細(xì)胞存活率越高。LDH試驗(yàn)則檢測細(xì)胞膜損傷程度，通過測量細(xì)胞損傷后釋放到培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶（LDH）酶活性，指示細(xì)胞毒性事件；LDH活性可通過比色或熒光法測定，數(shù)值越高代表細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。這些項(xiàng)目共同提供綜合毒性評估：MTT用于評估慢性或亞慢性毒性（如細(xì)胞增殖抑制），而LDH用于急性毒性（如細(xì)胞裂解）。標(biāo)準(zhǔn)檢測中，項(xiàng)目設(shè)定需根據(jù)樣品類型（如藥物濃度梯度）和細(xì)胞模型優(yōu)化，確保覆蓋IC50（半數(shù)抑制濃度）計算等關(guān)鍵參數(shù)，以支持定量分析。

檢測儀器

進(jìn)行MTT和LDH試驗(yàn)時，需要使用一系列專業(yè)檢測儀器，以確保實(shí)驗(yàn)的精度和效率。主要儀器包括：酶標(biāo)儀（如Thermo Scientific Multiskan GO或BioTek Synergy H1），用于讀取MTT試驗(yàn)的吸光度（通常在570nm波長）和LDH試驗(yàn)的比色/熒光信號（450nm或490nm激發(fā)波長）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)設(shè)備，如CO2培養(yǎng)箱（維持37°C、5% CO2環(huán)境）、生物安全柜（用于無菌操作）和離心機(jī)（用于細(xì)胞沉淀）；以及輔助設(shè)備，如微量移液器、96孔微孔板和分光光度計。在MTT試驗(yàn)中，還需配備溶解緩沖液（如DMSO或異丙醇）的振蕩器，以溶解甲臜結(jié)晶。對于LDH試驗(yàn)，常使用LDH檢測試劑盒（如Promega CytoTox 96?），其配套儀器可實(shí)現(xiàn)自動化測量。這些儀器需定期校準(zhǔn)和維護(hù)，遵循制造商指南及ISO 17025標(biāo)準(zhǔn)，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

檢測方法

MTT和LDH試驗(yàn)的檢測方法遵循標(biāo)準(zhǔn)化步驟，確保實(shí)驗(yàn)的一致性和可靠性。MTT試驗(yàn)方法包括：首先，在96孔板中接種細(xì)胞（如1×10^4個/孔），培養(yǎng)24-48小時使其貼壁；接著，添加待測樣品（如不同濃度藥物），孵育指定時間（通常24-72小時）；然后，加入MTT試劑（0.5mg/mL），孵育2-4小時，讓活細(xì)胞還原MTT為紫色甲臜；最后，加入溶解液（如DMSO），振蕩溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在570nm讀取吸光度值，計算細(xì)胞生存率（對照樣品為100%）。LDH試驗(yàn)方法則涉及：在同樣細(xì)胞接種和樣品處理步驟后，收集細(xì)胞上清液，離心去除碎片；添加LDH底物混合液，孵育30分鐘；用酶標(biāo)儀在490nm測量吸光度（或使用熒光模式），計算LDH釋放率（以最大LDH釋放孔為基準(zhǔn)）。兩種方法均需設(shè)置空白、陰性和陽性對照，并通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)減少誤差。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的檢測標(biāo)準(zhǔn)基于國際和行業(yè)規(guī)范，以確保結(jié)果的可比性和合規(guī)性。MTT和LDH試驗(yàn)的主要參考標(biāo)準(zhǔn)包括ISO 10993-5（醫(yī)療器械生物評價—第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)），該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了試驗(yàn)的設(shè)計、執(zhí)行和結(jié)果解讀要求，如細(xì)胞活力下降超過30%視為陽性毒性。其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有USP <87>（美國藥典細(xì)胞毒性測試指南）和OECD TG 129（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)導(dǎo)則）。這些標(biāo)準(zhǔn)要求：使用標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞系（如L929或CHO細(xì)胞）、嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（如pH值7.2-7.4）、采用統(tǒng)計方法分析數(shù)據(jù)（如t-test或ANOVA），并報告IC50值。此外，實(shí)驗(yàn)室需遵循GLP（良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范）或ISO/IEC 17025認(rèn)證，包括定期驗(yàn)證試劑批次和儀器性能。遵守這些標(biāo)準(zhǔn)不僅提升試驗(yàn)可靠性，還為監(jiān)管提交提供依據(jù)。