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陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-05 20:34:12 更新時(shí)間：2025-08-04 20:34:13

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性檢測(cè)

在臨床微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性檢測(cè)是一項(xiàng)至關(guān)重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。它旨在驗(yàn)證首次陽(yáng)性結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，排除假陽(yáng)性的可能性（如標(biāo)本污染或操作誤差），確保檢測(cè)結(jié)果能夠真實(shí)反映患者樣本中致病微生物的存在狀態(tài)。重復(fù)性檢測(cè)不僅為臨床診斷提供堅(jiān)實(shí)依據(jù)，也是實(shí)驗(yàn)室確保報(bào)告結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤、滿足醫(yī)學(xué)倫理和法規(guī)要求的核心步驟。尤其在涉及重大治療決策（如選擇強(qiáng)效或特殊抗生素）或具有公共衛(wèi)生意義的病原體（如結(jié)核分枝桿菌、多重耐藥菌）檢測(cè)時(shí)，其重要性更是不言而喻。

檢測(cè)項(xiàng)目

陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性檢測(cè)，其核心項(xiàng)目就是針對(duì)首次培養(yǎng)呈陽(yáng)性的菌株進(jìn)行再次確認(rèn)。這通常包括：

1. 目標(biāo)微生物的再分離與純化：從原始陽(yáng)性培養(yǎng)物（如平板、肉湯）中重新挑取典型菌落或可疑生長(zhǎng)物，接種到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，以獲得純培養(yǎng)物。

2. 形態(tài)學(xué)再確認(rèn)：對(duì)純化后的菌落進(jìn)行再次觀察（菌落形態(tài)、色素、溶血性等），并進(jìn)行革蘭染色、抗酸染色等顯微鏡檢查，確認(rèn)其形態(tài)特征與首次結(jié)果一致。

3. 關(guān)鍵的生化或免疫學(xué)鑒定復(fù)測(cè)：對(duì)首次鑒定中起決定性作用的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、觸酶、凝固酶、特定糖發(fā)酵/氧化試驗(yàn)）或免疫學(xué)試驗(yàn)（如乳膠凝集、熒光抗體檢測(cè)）進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。

4. 藥物敏感性試驗(yàn)復(fù)測(cè) (如適用)：對(duì)于首次藥敏試驗(yàn)顯示特殊耐藥表型（如MRSA、VRE、ESBL、碳青霉烯酶耐藥等）的菌株，可能需要對(duì)關(guān)鍵藥物的敏感性進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。

5. 分子生物學(xué)確認(rèn) (必要時(shí))：當(dāng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定存在模糊性或需要高特異性確證時(shí)（如結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、百日咳桿菌、少見(jiàn)病原體），可采用PCR、基因測(cè)序等分子方法進(jìn)行靶基因檢測(cè)。

檢測(cè)儀器

重復(fù)性檢測(cè)使用的儀器與其涉及的檢測(cè)項(xiàng)目密切相關(guān)，主要包括：

1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)設(shè)備： * 恒溫培養(yǎng)箱：提供特定溫度（如35-37°C）和氣體環(huán)境（需氧、微需氧、厭氧罐/工作站、CO₂培養(yǎng)箱）用于微生物再生長(zhǎng)。 * 生物安全柜：所有涉及活病原體操作（挑菌、涂片、分裝）必須在相應(yīng)等級(jí)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，確保人員與環(huán)境安全。

2. 形態(tài)學(xué)觀察儀器： * 光學(xué)顯微鏡：必備，用于觀察染色涂片（革蘭染色、抗酸染色等）中的細(xì)菌形態(tài)、排列、染色特性。

3. 生化/免疫學(xué)檢測(cè)儀器： * 自動(dòng)化微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)：如VITEK^? 2 (bioMérieux), BD Phoenix^TM (Becton Dickinson), MicroScan (Beckman Coulter) 等，可高效進(jìn)行重復(fù)的生化鑒定和藥敏試驗(yàn)。對(duì)于重復(fù)性檢測(cè)，常選擇獨(dú)立的測(cè)試卡或板條。 * 比濁儀：用于標(biāo)準(zhǔn)化菌懸液濃度（如0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?，是進(jìn)行手動(dòng)或自動(dòng)化藥敏試驗(yàn)、部分鑒定試驗(yàn)的前提。 * 酶標(biāo)儀/熒光讀數(shù)儀：用于讀取基于酶反應(yīng)或熒光標(biāo)記的免疫學(xué)或生化試驗(yàn)結(jié)果。

4. 分子生物學(xué)儀器 (必要時(shí))： * PCR儀：用于核酸擴(kuò)增。 * 電泳系統(tǒng)/實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：用于擴(kuò)增產(chǎn)物的分析或?qū)崟r(shí)檢測(cè)。 * 核酸提取儀：用于從菌落或培養(yǎng)物中提取DNA/RNA。 * 基因測(cè)序儀：用于菌株的精確分型或特定耐藥基因/毒力基因的確認(rèn)。

檢測(cè)方法

陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性檢測(cè)的具體操作流程通常遵循以下步驟：

1. 標(biāo)本/菌株復(fù)核：確認(rèn)原始記錄、標(biāo)本信息、分離平板/肉湯的標(biāo)識(shí)無(wú)誤。檢查原始平板/肉湯中的生長(zhǎng)情況是否支持陽(yáng)性報(bào)告。

2. 再分離純化：在生物安全柜內(nèi)，使用無(wú)菌接種環(huán)從原始陽(yáng)性培養(yǎng)物的典型區(qū)域或不同區(qū)域挑取菌落/生長(zhǎng)物，劃線接種到新鮮的非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板或TSA平板）上。置于合適的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)（或根據(jù)病原體需求延長(zhǎng)時(shí)間）。

3. 純培養(yǎng)物獲?。?觀察再分離平板，挑取形態(tài)均一、典型的單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

4. 關(guān)鍵鑒定試驗(yàn)重復(fù)： * 涂片鏡檢：制作純培養(yǎng)菌落的涂片，進(jìn)行革蘭染色（或其他必要染色），顯微鏡下觀察形態(tài)特征是否與首次結(jié)果一致。 * 關(guān)鍵生化/免疫試驗(yàn)：選擇2-3個(gè)對(duì)目標(biāo)菌最具鑒別意義且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的關(guān)鍵試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)（如葡萄球菌的凝固酶試驗(yàn)、鏈球菌的鏈球菌分組乳膠凝集、革蘭陰性桿菌的氧化酶試驗(yàn)等）。應(yīng)使用與首次試驗(yàn)相同或等效的試劑和方法。

5. 藥敏復(fù)測(cè) (如需要)：對(duì)于報(bào)告有特殊耐藥性的菌株，使用標(biāo)準(zhǔn)方法（如紙片擴(kuò)散法K-B法、自動(dòng)化儀器法、肉湯稀釋法）重復(fù)測(cè)試相關(guān)抗生素。關(guān)鍵是要確保菌懸液濃度標(biāo)準(zhǔn)化、孵育條件和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)一致。

6. 分子確認(rèn) (如需要)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室規(guī)程或臨床/流行病學(xué)要求，對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行特定的分子檢測(cè)。

7. 結(jié)果判讀與記錄：將重復(fù)檢測(cè)的所有結(jié)果與原始結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。只有當(dāng)重復(fù)結(jié)果支持原始陽(yáng)性鑒定結(jié)論時(shí)，原始報(bào)告才被視為最終確認(rèn)。所有重復(fù)試驗(yàn)的過(guò)程和結(jié)果必須詳細(xì)、清晰地記錄在案。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性檢測(cè)必須嚴(yán)格遵循國(guó)際、國(guó)內(nèi)或行業(yè)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)和指南，確保操作規(guī)范性和結(jié)果可比性：

1. 核心標(biāo)準(zhǔn)： * CLSI M52: Verification and Validation of Commercial Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Test Systems: 該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了如何驗(yàn)證包括重復(fù)性在內(nèi)的微生物檢測(cè)系統(tǒng)的性能，是制定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部重復(fù)性質(zhì)控方案的重要依據(jù)。 * ISO 15189: Medical laboratories — Requirements for quality and competence: 該國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，要求對(duì)檢測(cè)程序（包括確認(rèn)程序）進(jìn)行驗(yàn)證，并實(shí)施質(zhì)量控制，重復(fù)性檢測(cè)是其重要體現(xiàn)之一。

2. 國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)： * 各國(guó)通常有自己的臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程或指南，例如中國(guó)的《臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》、《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》等，其中會(huì)包含對(duì)陽(yáng)性結(jié)果復(fù)核或確認(rèn)的建議和要求。 * 針對(duì)特定病原體可能有專門的指南（如結(jié)核病、性傳播疾病實(shí)驗(yàn)室診斷指南）。

3. 關(guān)鍵指標(biāo)與要求： * 一致性：重復(fù)檢測(cè)的關(guān)鍵結(jié)果（形態(tài)、關(guān)鍵生化/免疫反應(yīng)）必須與原始結(jié)果一致。 * 操作標(biāo)準(zhǔn)化：必須使用標(biāo)準(zhǔn)化的方法（如CLSI M02, M07, M100系列文件規(guī)定的藥敏試驗(yàn)方法）、試劑和培養(yǎng)基。 * 質(zhì)控：重復(fù)試驗(yàn)過(guò)程中必須包含相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性質(zhì)控菌株/樣本，以確保試劑和方法的有效性。 * 記錄可追溯：完整的記錄（原始結(jié)果、重復(fù)操作過(guò)程、重復(fù)結(jié)果、操作者、日期）是標(biāo)準(zhǔn)符合性的關(guān)鍵證據(jù)。

4. 自動(dòng)化系統(tǒng)的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)：如果使用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，其本身應(yīng)通過(guò)性能驗(yàn)證（通常要求對(duì)關(guān)鍵目標(biāo)菌/耐藥表型進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，計(jì)算符合率/重復(fù)性），并符合制造商聲明的精密度要求。

5. 特定情形標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于某些“危急值”病原體（如血液培養(yǎng)中的革蘭陰性桿菌、腦脊液中的任何細(xì)菌/真菌）或特殊耐藥菌，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有更嚴(yán)格的、強(qiáng)制性的重復(fù)確認(rèn)流程，其標(biāo)準(zhǔn)可能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部SOP中明確規(guī)定。

總結(jié)：陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性檢測(cè)是微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證的基石。通過(guò)系統(tǒng)性地應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)項(xiàng)目、規(guī)范的儀器操作、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測(cè)方法，并嚴(yán)格遵循國(guó)內(nèi)外權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室能夠最大限度地保證陽(yáng)性報(bào)告結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，為臨床診斷和治療提供值得信賴的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在其質(zhì)量管理體系中明確制定關(guān)于何種情況需要重復(fù)檢測(cè)、重復(fù)哪些項(xiàng)目、采用何種方法以及結(jié)果接受標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)程序。