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空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-04 06:48:49 更新時(shí)間：2025-08-03 06:48:50

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

首段

空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法檢測(cè)是一種廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、病毒學(xué)及生物制藥領(lǐng)域的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞在固相瓊脂中形成的空斑來(lái)定量評(píng)估病毒滴度、抗體中和活性或細(xì)胞免疫功能。該方法基于免疫學(xué)原理，當(dāng)病毒或抗體作用于宿主細(xì)胞時(shí)，在瓊脂覆蓋下形成可見(jiàn)的空斑區(qū)域，每個(gè)空斑代表一個(gè)感染單元或抗體作用點(diǎn)，從而提供高靈敏度的定量數(shù)據(jù)。瓊脂固相法利用瓊脂糖凝膠作為半固體基質(zhì)，固定細(xì)胞并限制病毒擴(kuò)散，確?？瞻叩那逦梢暬哂胁僮骱?jiǎn)便、結(jié)果可靠等優(yōu)勢(shì)。該方法在疫苗研發(fā)、疾病診斷（如流感或HIV檢測(cè)）、抗體藥物評(píng)價(jià)中扮演關(guān)鍵角色，尤其在評(píng)估中和抗體效價(jià)時(shí)，能模擬體內(nèi)環(huán)境，為臨床前研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。盡管現(xiàn)代分子技術(shù)發(fā)展迅速，但瓊脂固相法因其直觀(guān)性和成本效益，仍是實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)之一。

檢測(cè)項(xiàng)目

空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法主要用于檢測(cè)病毒滴度、中和抗體活性以及細(xì)胞免疫反應(yīng)等關(guān)鍵項(xiàng)目。具體包括：病毒滴度測(cè)定（如流感病毒、麻疹病毒或單純皰疹病毒等），通過(guò)空斑數(shù)量計(jì)算感染性病毒顆粒的濃度；中和抗體檢測(cè)（如新冠抗體或狂犬病抗體），評(píng)估抗體阻斷病毒感染的能力；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）活性測(cè)定，檢測(cè)免疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。這些項(xiàng)目在疫苗效力測(cè)試、疾病診斷和免疫治療評(píng)價(jià)中至關(guān)重要，能提供定量數(shù)據(jù)如空斑形成單位（PFU/mL）或中和滴度（NT50），為科研和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

檢測(cè)儀器

進(jìn)行空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法檢測(cè)時(shí)，需要一系列專(zhuān)業(yè)儀器以確保準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。主要儀器包括：生物安全柜（Class II型），用于無(wú)菌操作以防止污染；二氧化碳培養(yǎng)箱（設(shè)定37°C和5% CO?），模擬體內(nèi)環(huán)境以維持細(xì)胞生長(zhǎng)；倒置顯微鏡（配備照相系統(tǒng)），用于觀(guān)察和計(jì)數(shù)空斑；離心機(jī)（低速型），用于細(xì)胞懸液的制備；恒溫水浴鍋（維持56°C），用于瓊脂糖凝膠的熔化；微量移液器（覆蓋1μL-1000μL范圍），用于精確加樣；以及培養(yǎng)皿或六孔板，作為瓊脂固相的載體。輔助設(shè)備如冰箱（-20°C存儲(chǔ)試劑）、pH計(jì)（校準(zhǔn)培養(yǎng)基）和自動(dòng)計(jì)數(shù)軟件可提高效率。這些儀器需定期校準(zhǔn)，確保檢測(cè)結(jié)果符合規(guī)范。

檢測(cè)方法

空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法的檢測(cè)方法主要包括以下步驟：首先，準(zhǔn)備單層宿主細(xì)胞（如Vero或MDCK細(xì)胞），在培養(yǎng)板中培養(yǎng)至融合狀態(tài)；其次，稀釋病毒或血清樣本，加入細(xì)胞層并孵育（通常1-2小時(shí)），使病毒吸附；接著，覆蓋一層熔化的瓊脂糖培養(yǎng)基（含中性紅或結(jié)晶紫染色劑），固化后形成半固體層，限制病毒擴(kuò)散；然后，將培養(yǎng)板置于CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24-72小時(shí)），期間病毒或抗體作用導(dǎo)致細(xì)胞裂解形成空斑；最后，移除瓊脂層，用甲醛固定細(xì)胞，染色（如龍膽紫）使空斑可視化，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑數(shù)量。關(guān)鍵控制點(diǎn)包括瓊脂濃度（通常0.5%-1%）、孵育時(shí)間優(yōu)化和陰性/陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置，方法需標(biāo)準(zhǔn)化以避免主觀(guān)誤差。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

空斑形成細(xì)胞測(cè)定瓊脂固相法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)遵循國(guó)際和行業(yè)規(guī)范，確保數(shù)據(jù)的可比性和可靠性。主要標(biāo)準(zhǔn)包括：ISO 15189（醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系），要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境、儀器校準(zhǔn)和人員培訓(xùn)符合規(guī)定；WHO指南（如針對(duì)流感病毒中和試驗(yàn)），定義空斑計(jì)數(shù)的可接受范圍和重復(fù)性（如變異系數(shù)≤15%）；USP<123>（美國(guó)藥典通則），規(guī)范病毒滴度測(cè)定的驗(yàn)證參數(shù)，包括線(xiàn)性范圍、精密度和特異性；以及GLP（良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范），強(qiáng)調(diào)原始數(shù)據(jù)記錄和報(bào)告完整性。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部需建立SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作程序），涵蓋樣本處理、對(duì)照設(shè)置（如病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照）和結(jié)果計(jì)算（PFU/mL公式：空斑數(shù)×稀釋因子/樣本體積）。此外，定期參加外部質(zhì)控（如CAP認(rèn)證）是維持檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。