熱原/細菌內(nèi)毒素檢測：保障藥品與醫(yī)療器械安全的核心屏障
熱原（Pyrogen），特別是細菌內(nèi)毒素（Endotoxin），是存在于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）復(fù)合物，是引發(fā)人體或動物體發(fā)熱反應(yīng)（即熱原反應(yīng)）的最主要物質(zhì)之一。當含有超量熱原/細菌內(nèi)毒素的注射劑、血液制品、生物制品、植入性醫(yī)療器械等進入人體血液循環(huán)系統(tǒng)時，可刺激單核細胞和巨噬細胞釋放內(nèi)源性致熱原，導(dǎo)致患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱、血壓下降，嚴重時甚至休克、死亡。因此，熱原/細菌內(nèi)毒素檢測是藥品、生物制品、醫(yī)療器械（尤其是侵入性器械）生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，是保障用藥和用械安全的強制性要求，也是各國藥典（如中國藥典ChP、美國藥典USP、歐洲藥典EP）和藥品監(jiān)管機構(gòu)（如FDA、EMA、NMPA）嚴格規(guī)定的核心檢測項目之一。
根據(jù)檢測原理和對象的不同，熱原檢測主要分為兩大類：熱原檢查法（家兔法）和細菌內(nèi)毒素檢查法（BET, Bacterial Endotoxin Test，鱟試劑法）。熱原檢查法是一種體內(nèi)試驗，直接檢測樣品引起哺乳動物（通常是家兔）體溫升高的能力，能檢測多種來源的熱原（包括內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?。細菌?nèi)毒素檢查法則是一種靈敏、特異的體外試驗，利用鱟（hòu）血變形細胞裂解物中的酶系統(tǒng)與內(nèi)毒素發(fā)生特異性凝集或顯色反應(yīng)的原理，專一性地檢測樣品中細菌內(nèi)毒素的含量。目前，細菌內(nèi)毒素檢查法因其靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、成本相對較低且無需使用實驗動物等優(yōu)勢，已成為檢測注射劑等藥品內(nèi)毒素限量的首選方法，并在可能的情況下逐步替代熱原檢查法。但家兔法對于某些無法通過BET有效檢測的物質(zhì)（如部分放射性藥品、混懸劑、膠體溶液等）或產(chǎn)品研發(fā)階段的篩選仍有其不可替代的價值。
核心檢測項目
熱原/細菌內(nèi)毒素檢測的核心項目圍繞著限值（Limit）的符合性展開：
1. 細菌內(nèi)毒素限量檢查：這是最常規(guī)的檢測項目。通過定性的凝膠法（Gel-Clot）或定量的光度測定法（包括濁度法和顯色基質(zhì)法），測定供試品溶液中的內(nèi)毒素含量是否低于該品種規(guī)定的最大允許限量（通常表示為 EU/mL, EU/mg, EU/Unit 等）。
2. 熱原檢查（家兔法）：通過測量家兔注射供試品溶液后的體溫升高情況，判斷供試品是否引起熱原反應(yīng)。結(jié)果以單只兔體溫升高值和兔群體溫反應(yīng)總和來判定是否符合規(guī)定。
3. 干擾試驗：這是細菌內(nèi)毒素檢查法中至關(guān)重要的預(yù)試驗。旨在確認供試品溶液本身或其配方成分是否會抑制或增強鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)，從而影響檢測結(jié)果的準確性。只有通過干擾試驗驗證，證明供試品溶液在規(guī)定的稀釋倍數(shù)下不干擾檢測（即回收率在50%-200%范圍內(nèi)），后續(xù)的正式限量檢查結(jié)果才有效。
4. 方法驗證與確認：在建立新的細菌內(nèi)毒素檢查方法或改變原有方法時，需要進行完整的方法學(xué)驗證，包括專屬性、準確性（回收率）、精密度、定量限/檢測限、線性與范圍、耐用性等（根據(jù)定量或定性方法要求不同）。
關(guān)鍵檢測儀器
檢測的實施依賴于專用的精密儀器：
1. 細菌內(nèi)毒素檢測儀（光度法）：核心設(shè)備。用于光度測定法（動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色法、終點顯色法），精確控制反應(yīng)溫度（通常是37℃±1℃），并連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)溶液濁度或吸光度的變化，通過內(nèi)置軟件計算反應(yīng)時間或終點吸光度，進而定量測定內(nèi)毒素濃度。通常配備恒溫孵育模塊、光電檢測系統(tǒng)、樣品盤/反應(yīng)管架和數(shù)據(jù)采集分析軟件。
2. 恒溫水浴箱/干式恒溫器：用于凝膠法試驗，提供精確穩(wěn)定的溫育環(huán)境（通常為37℃±1℃），確保鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)充分進行。
3. 漩渦混合器：用于充分混勻鱟試劑、樣品/溶液和標準品。
4. 微量移液器及無菌無熱原槍頭：進行高精度液體移取的關(guān)鍵工具，必須保證無菌且無熱原。量程需覆蓋所需范圍（如10μL, 25μL, 100μL, 1mL）。
5. 旋渦混合器：用于充分混勻樣品或溶液。
6. 熱原檢查專用設(shè)備（家兔法）：包括符合規(guī)定的家兔飼養(yǎng)設(shè)施、精確測溫設(shè)備（如電子測溫計，精度達0.1℃）、兔固定裝置、注射裝置（注射器、針頭）、以及用于加熱和固定體溫探頭的裝置等。
7. 超凈工作臺/生物安全柜：提供無菌操作環(huán)境，防止實驗過程中樣品污染。
8. 烘箱/干熱滅菌器：用于玻璃器皿（如試管、安瓿、稀釋容器）的去熱原處理（通常需250℃干烤至少30分鐘或180℃干烤2小時以上）。
主要檢測方法
主要遵循藥典規(guī)定的方法：
1. 細菌內(nèi)毒素檢查法（BET）：
* 凝膠法（Gel-Clot Technique）： 最經(jīng)典、應(yīng)用廣泛的定性或半定量方法。將鱟試劑溶解后，與等體積供試品溶液或標準內(nèi)毒素溶液在試管或微量反應(yīng)板孔中混合，于37℃±1℃水浴中孵育規(guī)定時間（通常60±2分鐘）。取出后小心倒轉(zhuǎn)180度觀察：形成堅實凝膠并保持在管底（孔底）為陽性（+），未形成凝膠或凝膠不能保持完整呈流動狀為陰性（-）。通過與平行操作的系列內(nèi)毒素標準溶液的凝固終點濃度比較，判斷供試品是否合格（如用標示靈敏度λ的鱟試劑，供試品溶液在最大有效稀釋倍數(shù)下為陰性即合格）。
* 光度測定法（Photometric Techniques）： 定量方法。
* 濁度法（Turbidimetric）： 檢測反應(yīng)混合物因形成凝膠導(dǎo)致濁度增加。動態(tài)濁度法監(jiān)測濁度隨時間的變化率（與內(nèi)毒素濃度對數(shù)成線性關(guān)系）；終點濁度法在反應(yīng)終點測量濁度值（與內(nèi)毒素濃度成線性關(guān)系）。
* 顯色基質(zhì)法（Chromogenic）： 利用人工合成的顯色底物（如Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）代替天然凝固蛋白原。內(nèi)毒素激活的凝集酶系統(tǒng)水解顯色底物釋放出黃色對硝基苯胺（pNA），在405nm波長處檢測吸光度。動態(tài)顯色法監(jiān)測吸光度變化率；終點顯色法在反應(yīng)終點加入顯色終止液后測量吸光度。
2. 熱原檢查法（家兔法）： 選取符合規(guī)定的健康家兔，測定其正常體溫后，在規(guī)定時間內(nèi)經(jīng)耳緣靜脈注射規(guī)定劑量的供試品溶液。在注射后定時（通常1, 2, 3小時）測量其體溫。根據(jù)每只兔體溫升高的最大值（ΔT）以及同組兔體溫升高的總和（ΣΔT），按照藥典規(guī)定的判定標準（如ChP：每只兔ΔT≤0.5℃且ΣΔT≤1.3℃）來判斷供試品是否合格。
核心檢測標準
檢測活動嚴格遵循以下權(quán)威標準：
1. 各國藥典： 這是最根本、最具法律效力的標準。
* 《中華人民共和國藥典》（ChP） - 通則1143 細菌內(nèi)毒素檢查法， 通則1142 熱原檢查法。
* 《美國藥典》（USP） - Chapter <85> Bacterial Endotoxins Test, Chapter <151> <
CMA認證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認可
實驗室認可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認證
質(zhì)量管理體系認證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
掃一掃，更多精彩
