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固定有效性貼壁性檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-03 04:58:26 更新時(shí)間：2025-08-02 04:58:26

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

固定有效性貼壁性檢測：關(guān)鍵因素與應(yīng)用

在生物醫(yī)學(xué)研究、組織工程、藥物篩選及醫(yī)療器械開發(fā)等諸多領(lǐng)域，細(xì)胞的貼壁性（Adhesion）是至關(guān)重要的基礎(chǔ)特性。細(xì)胞能否有效、穩(wěn)定地貼附在特定的基底（如培養(yǎng)皿、生物材料支架、微載體或植入物表面）上，直接決定了細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移乃至其功能表達(dá)。因此，“固定有效性貼壁性檢測”成為評價(jià)材料生物相容性、篩選促粘附因子、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件以及評估植入物性能的核心檢測項(xiàng)目之一。其核心目標(biāo)是量化評估細(xì)胞或生物分子在特定表面或基質(zhì)上的附著強(qiáng)度、持久性和分布均勻性，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用的可靠性與可重復(fù)性。本檢測貫穿于材料研發(fā)、工藝優(yōu)化及最終產(chǎn)品質(zhì)量控制的全過程。

核心檢測項(xiàng)目

固定有效性貼壁性檢測通常圍繞以下幾個(gè)關(guān)鍵維度展開：

1. 初始貼附率 (Initial Attachment Rate): 評估細(xì)胞在接觸基底后的短時(shí)間內(nèi)（通常為幾十分鐘到數(shù)小時(shí)）成功附著并開始鋪展的比例。這反映了材料表面對細(xì)胞的早期吸引力。

2. 貼壁強(qiáng)度 (Adhesion Strength): 衡量已貼壁細(xì)胞抵抗外界脫附力（如剪切力、離心力、酶解力）的能力。這是評價(jià)貼壁穩(wěn)定性和長期培養(yǎng)可行性的核心指標(biāo)。

3. 貼壁形態(tài)與鋪展?fàn)顟B(tài) (Morphology and Spreading): 觀察貼壁細(xì)胞的形態(tài)變化（如偽足形成、細(xì)胞鋪展面積、細(xì)胞極性）和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。良好的貼壁通常伴隨顯著的鋪展和特定的形態(tài)特征。

4. 貼壁持久性與時(shí)間依賴性 (Long-term Adhesion Stability): 評估細(xì)胞在基底上長時(shí)間（數(shù)天甚至數(shù)周）培養(yǎng)后維持貼壁狀態(tài)的能力，考察貼壁的穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化。

5. 分布均勻性 (Distribution Uniformity): 檢查細(xì)胞在基底表面的分布是否均勻，是否存在聚集或特定區(qū)域缺失的情況。

6. 功能性貼壁 (Functional Adhesion): 評估貼壁后細(xì)胞是否能夠正常執(zhí)行其生物學(xué)功能，如增殖、分化、分泌特定因子或形成功能性連接（對共培養(yǎng)或組織構(gòu)建尤為重要）。

關(guān)鍵檢測儀器

進(jìn)行貼壁性檢測需要依賴多種精密儀器：

1. 倒置光學(xué)顯微鏡 (Inverted Optical Microscope): 最基礎(chǔ)也是最重要的工具，用于直接觀察細(xì)胞的貼壁狀況、計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)量、評估形態(tài)和分布均勻性。通常配備相差或微分干涉（DIC）功能以觀察活細(xì)胞。

2. 熒光顯微鏡 (Fluorescence Microscope): 用于對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色（如活/死染色、細(xì)胞核/骨架染色）后的觀察，更精確地評估細(xì)胞活性、形態(tài)、骨架結(jié)構(gòu)和特定分子的表達(dá)定位。

3. 激光掃描共聚焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM): 提供高分辨率的三維成像，特別適合精確觀察細(xì)胞與基底界面的相互作用、細(xì)胞骨架在Z軸上的分布以及多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的貼壁情況。

4. 掃描電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM): 提供超高分辨率的表面形貌信息，用于觀察細(xì)胞在材料表面的超微結(jié)構(gòu)、偽足細(xì)節(jié)及緊密接觸的程度（通常需要固定脫水等處理，觀察非活態(tài)）。

5. 原子力顯微鏡 (Atomic Force Microscope, AFM): 可直接測量單個(gè)活細(xì)胞與基底之間的粘附力（主要是范德華力、靜電力等），提供納米級別的力學(xué)信息。

6. 離心力/剪切力裝置 (Centrifuge Adhesion Assay / Flow Chamber):

離心法： 將貼有細(xì)胞的基底置于特定角度的支架上，通過離心產(chǎn)生垂直于基底的脫附力，根據(jù)脫落細(xì)胞比例或剩余細(xì)胞數(shù)量計(jì)算貼壁強(qiáng)度。
流動(dòng)腔法： 讓培養(yǎng)液在密閉腔室中以可控流速流過貼壁細(xì)胞表面，產(chǎn)生平行于基底的剪切力，評估細(xì)胞抵抗流體剪切的能力。

7. 酶標(biāo)儀 (Microplate Reader): 在基于染色的定量方法（如結(jié)晶紫染色法、MTT法間接反映活細(xì)胞數(shù)）中，用于測量吸光度值，從而定量計(jì)算貼壁細(xì)胞的數(shù)量或活性。

8. 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀/圖像分析軟件 (Cell Counter / Image Analysis Software): 輔助顯微鏡進(jìn)行自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)分析。

常用檢測方法

根據(jù)檢測目標(biāo)的不同，選擇適合的方法：

1. 直接觀察與計(jì)數(shù)法： * 將細(xì)胞接種到待測基底上，孵育特定時(shí)間。 * 用PBS輕柔沖洗去除未貼壁細(xì)胞。 * 直接在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)視野中的貼壁細(xì)胞數(shù)。 * 可結(jié)合不同時(shí)間點(diǎn)觀察計(jì)算初始貼附率或隨時(shí)間變化趨勢。 * 簡單直觀，是基礎(chǔ)評價(jià)方法。

2. 染色定量法 (如結(jié)晶紫染色法)： * 細(xì)胞接種、貼壁、沖洗后，用固定液（如多聚甲醛或甲醇）固定細(xì)胞。 * 用結(jié)晶紫等染料染色貼壁細(xì)胞。 * 溶解染料，用酶標(biāo)儀測量特定波長下的吸光度值。 * 吸光度值間接代表貼壁細(xì)胞的數(shù)目。適用于高通量篩選。

3. 活力指示定量法 (如MTT/XTT法)： * 在貼壁、沖洗后，加入MTT/XTT等染料。 * 活細(xì)胞線粒體酶將染料還原為Formazan結(jié)晶。 * 溶解結(jié)晶，測量吸光度。 * 吸光度值代表貼壁且有活性的細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)評估貼壁性和活性。

4. 離心脫附法： * 細(xì)胞接種、貼壁、沖洗后，將基底倒置固定于離心機(jī)專用支架（通常有一定傾角）。 * 在特定轉(zhuǎn)速和時(shí)間下離心，利用離心力使貼附不牢的細(xì)胞脫落。 * 固定并染色剩余細(xì)胞（或收集脫落細(xì)胞計(jì)數(shù)）。 * 計(jì)算貼壁率/脫落率或比較不同條件下的剩余細(xì)胞量。直接測量抵抗垂直方向拉力的能力。

5. 流動(dòng)腔剪切法： * 細(xì)胞在流動(dòng)腔的基底上貼壁、生長。 * 啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，使培養(yǎng)液以設(shè)定的流速（產(chǎn)生已知壁面剪切應(yīng)力）流過細(xì)胞表面一段時(shí)間。 * 停止流動(dòng)，沖洗，染色固定。 * 顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)殘留的貼壁細(xì)胞比例。模擬體內(nèi)血流環(huán)境，評估細(xì)胞抵抗流體剪切應(yīng)力的能力。

6. 酶解脫附法 (如Trypsinization Assay)： * 細(xì)胞貼壁后，加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的胰蛋白酶溶液。 * 記錄從加入胰酶到細(xì)胞完全變圓、脫離所需的時(shí)間（脫附時(shí)間）。 * 或記錄固定作用時(shí)間（如5分鐘）后用酶標(biāo)儀測量脫落的細(xì)胞量/剩余細(xì)胞量。 * 時(shí)間越長或剩余細(xì)胞越多，表明細(xì)胞間或細(xì)胞-基質(zhì)間的粘附作用越強(qiáng)。

7. 形態(tài)學(xué)分析： 結(jié)合顯微鏡圖像（尤其是相差、熒光、共聚焦），利用圖像分析軟件定量測量細(xì)胞的鋪展面積、周長、形狀因子（如圓形度）、偽足數(shù)量/長度等參數(shù)，評估貼壁質(zhì)量。