您現(xiàn)在的位置：首頁 > 檢測項目 > 其他檢測

核酸提取效率檢測

1對1客服專屬服務(wù)，免費制定檢測方案，15分鐘極速響應(yīng)

可選形式：電子報告紙質(zhì)報告

可選語言：中文報告英文報告

發(fā)布時間：2025-08-02 23:00:34 更新時間：2025-08-01 23:00:35

點擊：0

作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

核酸提取效率檢測

核酸提取是分子生物學(xué)、臨床診斷、病原體檢測、法醫(yī)學(xué)及基因組學(xué)研究等一系列應(yīng)用中的關(guān)鍵起始步驟。提取效率的高低直接決定了后續(xù)實驗（如PCR、測序、雜交等）的成敗與結(jié)果的準(zhǔn)確性。低效的核酸提取會導(dǎo)致目標(biāo)核酸的損失、純度不足或存在抑制因子，從而引發(fā)假陰性結(jié)果、擴增效率低下或測序數(shù)據(jù)質(zhì)量差等問題。因此，對核酸提取效率進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的檢測和評估，是確保實驗數(shù)據(jù)可靠性與重現(xiàn)性的必要環(huán)節(jié)。它不僅是優(yōu)化提取流程的重要依據(jù)，更是實驗室質(zhì)量控制（QC）體系的核心組成部分。

核心檢測項目

核酸提取效率檢測通常圍繞以下幾個核心項目進(jìn)行：

1. 核酸產(chǎn)量 (Yield): 指最終獲得的核酸總量，通常以質(zhì)量單位（如納克, ng; 微克, μg）或摩爾濃度（如納摩爾, nM）表示。這是衡量提取效率最直觀的指標(biāo)。

2. 核酸純度 (Purity): 主要評估核酸樣品中是否存在蛋白質(zhì)、鹽離子、有機溶劑（如苯酚、乙醇）、碳水化合物或其它核酸（如DNA樣品中混雜RNA，或反之）等污染物。純度不足會嚴(yán)重影響下游應(yīng)用的效率。

3. 核酸完整性 (Integrity): 尤其對于長片段DNA或全長RNA（如mRNA）至關(guān)重要。指核酸分子是否發(fā)生降解或斷裂。降解的核酸可能導(dǎo)致擴增失敗或信息丟失。

4. 功能性/抑制物檢測 (Functionality/Inhibitor Presence): 評估提取的核酸是否適合下游應(yīng)用（如能否被高效擴增或酶切），并檢測是否存在抑制PCR等酶促反應(yīng)的物質(zhì)。

常用檢測儀器

根據(jù)檢測項目的不同，常用的儀器包括：

1. 紫外/可見光分光光度計 (UV-Vis Spectrophotometer):

原理： 利用核酸在特定波長（如260nm）有最大吸收峰的特性。
應(yīng)用： 快速測定核酸的濃度（通過A260）和純度（通過A260/A280比值評估蛋白污染，A260/A230比值評估鹽類或有機溶劑污染）。
優(yōu)點： 快速、簡便、樣品消耗少。
缺點： 無法區(qū)分DNA和RNA；對污染物敏感度有限；無法評估完整性；高濃度時需稀釋。

2. 熒光分光光度計/微量熒光計 (Fluorometer):

原理： 利用能與核酸特異性結(jié)合并發(fā)出熒光的染料（如PicoGreen? 測dsDNA, RiboGreen? 測RNA, Quant-iT?系列染料）。
應(yīng)用： 高靈敏度、高特異性地定量核酸濃度（尤其是低濃度樣品），對常見污染物耐受性相對較好。
優(yōu)點： 靈敏度遠(yuǎn)高于紫外法；能區(qū)分DNA/RNA（使用特異性染料）；對鹽和溶劑等污染物抗干擾能力較強。
缺點： 需要染料；成本相對較高；不同染料對雙鏈/單鏈核酸靈敏度不同。

3. 凝膠電泳系統(tǒng) (Gel Electrophoresis System):

原理： 核酸在電場作用下在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中遷移，遷移速率與分子大小成反比。
應(yīng)用： 直觀評估DNA或RNA的完整性（觀察條帶銳利度、有無拖尾/降解）、粗略估計濃度和大?。ㄍㄟ^與已知Marker比較）。
優(yōu)點： 直觀展示完整性；可同時分析多個樣品；成本較低。
缺點： 定量不精確；通量低；步驟繁瑣；需使用核酸染料（如EB, GelRed?）和成像系統(tǒng)。

4. 微流控電泳系統(tǒng) (Microfluidic Electrophoresis System - e.g., Agilent Bioanalyzer, TapeStation):

原理： 在微流控芯片上實現(xiàn)電泳分離，結(jié)合熒光檢測。
應(yīng)用： 高分辨率、自動化地評估核酸的濃度、大小分布和完整性（提供數(shù)字化指標(biāo)如DNA Integrity Number - DIN, RNA Integrity Number - RIN）。
優(yōu)點： 快速、自動化、高通量；數(shù)字化結(jié)果，客觀性強；靈敏度高；樣品消耗極少；提供詳細(xì)的片段分布信息。
缺點： 儀器和耗材成本高。

5. 實時熒光定量PCR儀 (Real-Time qPCR Instrument):

原理： 通過PCR擴增過程中熒光信號的積累實時監(jiān)測擴增情況。
應(yīng)用：
- 功能性檢測： 直接檢測提取的核酸是否能被有效擴增，擴增效率（Efficiency）和循環(huán)閾值（Ct值）可間接反映核酸的質(zhì)量和是否存在抑制物。
- 絕對定量： 使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線精確定量樣品中特定靶基因的拷貝數(shù)，從而計算提取效率（如：從初始樣本量中回收的靶基因拷貝數(shù)百分比）。
- 抑制物檢測： 在樣品中加入已知量的外源DNA（如spike-in control）并進(jìn)行qPCR，觀察其Ct值是否偏移來判斷抑制物存在及強度。
優(yōu)點： 直接評估核酸在下游應(yīng)用中的實際效能；靈敏度極高；可精確定量特定序列；是檢測抑制物的金標(biāo)準(zhǔn)方法之一。
缺點： 成本高；步驟較復(fù)雜；需要設(shè)計特異性引物探針；結(jié)果受PCR體系本身影響。

6. 數(shù)字PCR儀 (Digital PCR - dPCR Instrument):

原理： 將樣品分割成成千上萬個微反應(yīng)單元進(jìn)行獨立PCR，通過終點熒光信號進(jìn)行絕對計數(shù)。
應(yīng)用： 無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實現(xiàn)核酸分子的絕對定量（拷貝數(shù)/μL），用于精確定量特定靶標(biāo)，計算提取效率。
優(yōu)點： 絕對定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線；對抑制物耐受性通常優(yōu)于qPCR；精密度高。
缺點： 儀器和耗材成本最高；通量相對較低；數(shù)據(jù)分析相對復(fù)雜。

主要檢測方法

結(jié)合上述儀器，常見的檢測方法包括：

1. 吸光度比值法 (A260/A280, A260/A230): 使用紫外分光光度計，通過計算吸光度比值快速評估純度。

2. 熒光染料結(jié)合法: 使用熒光分光光度計和特異性染料，提供更準(zhǔn)確的濃度定量。

3. 電泳分析:

傳統(tǒng)瓊脂糖/聚丙烯酰胺凝膠電泳: 目視評估濃度、大小和完整性。
微流控芯片電泳: 自動化獲取濃度、大小分布和完整性評分（DIN/RIN）。

4. qPCR/dPCR 擴增法:

擴增效率/閾值循環(huán) (Ct) 評估: 直接反映核酸的可擴增性及抑制物存在。
內(nèi)參基因/管家基因擴增: 評估樣品間提取效率的一致性（相對定量）。
外源spike-in 對照擴增: 精確定量回收效率并檢測抑制物（絕對定量）。
特定靶基因絕對定量: 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(qPCR)或直接計數(shù)(dPCR)計算回收的靶基因絕對量，進(jìn)而計算提取效率（%回收率 = (回收量 / 理論起始量) × 100%）。