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I型膠原蛋白分子量檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-08-02 15:26:48 更新時(shí)間：2025-08-01 15:26:48

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

I型膠原蛋白分子量檢測(cè)：關(guān)鍵技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)解析

I型膠原蛋白是人體和動(dòng)物結(jié)締組織中含量最豐富的膠原蛋白類(lèi)型，主要存在于皮膚、骨骼、肌腱等部位，具有維持組織強(qiáng)度、彈性和修復(fù)功能。其分子結(jié)構(gòu)的完整性直接關(guān)系到生物活性與應(yīng)用價(jià)值（如生物材料、醫(yī)藥、化妝品）。I型膠原蛋白在天然狀態(tài)下以三股螺旋結(jié)構(gòu)存在，分子量約為300 kDa，由兩條α1(I)鏈和一條α2(I)鏈組成。分子量檢測(cè)是其質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)，能有效反映膠原蛋白的提取工藝是否造成降解、純度是否達(dá)標(biāo)以及批次間一致性，對(duì)確保產(chǎn)品安全性和功效至關(guān)重要。

檢測(cè)項(xiàng)目

核心檢測(cè)項(xiàng)目聚焦于：

1. 分子量測(cè)定：精確測(cè)定完整I型膠原蛋白分子及其α鏈亞基的分子量（α1(I)約95 kDa，α2(I)約95 kDa）。

2. 純度與均一性分析：評(píng)估樣品中目標(biāo)I型膠原蛋白的占比，識(shí)別是否存在其他膠原類(lèi)型（如III型）或非膠原蛋白污染。

3. 降解產(chǎn)物檢測(cè)：篩查是否存在因酶解或熱處理產(chǎn)生的低分子量肽段碎片（如明膠片段）。

4. 亞基組成確認(rèn)：驗(yàn)證α1(I)與α2(I)鏈的比例是否符合理論值（2:1）。

檢測(cè)儀器

主要依賴(lài)以下高分辨率分析設(shè)備：

1. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）系統(tǒng)：配備高靈敏度染色（如銀染、考馬斯亮藍(lán)）或熒光檢測(cè)模塊，是初篩和半定量分析分子量及純度的基礎(chǔ)工具。

2. 高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)（HPLC）：常與以下檢測(cè)器聯(lián)用：
- 尺寸排阻色譜（SEC-HPLC）：基于流體力學(xué)體積分離，評(píng)估完整分子大小及聚集狀態(tài)。
- 多角度激光光散射檢測(cè)器（MALS）：聯(lián)用SEC，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品即可絕對(duì)測(cè)定分子量及分子量分布。

3. 質(zhì)譜儀（MS）：
- 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）：適用于完整蛋白或大片段分子量快速測(cè)定。
- 電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）：尤其適用于高精度分子量測(cè)定及復(fù)雜混合物分析，常與液相色譜聯(lián)用（LC-ESI-MS）。

檢測(cè)方法

標(biāo)準(zhǔn)化操作流程通常包括：

1. 樣品前處理：將樣品溶解于含變性劑（如SDS）和還原劑（如β-巰基乙醇、DTT）的緩沖液中，破壞二硫鍵并使蛋白線(xiàn)性化。

2. SDS-PAGE分析：
  - 配制合適濃度的分離膠（如6%或8%用于完整膠原，12%-15%用于α鏈）。
  - 上樣已知分子量的蛋白Marker作為對(duì)照。
  - 電泳分離后染色、脫色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析條帶位置，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算分子量。

3. SEC-MALS分析：
  - 將樣品注入預(yù)先標(biāo)定的SEC色譜柱（如TSKgel G系列）。
  - 洗脫液同時(shí)流經(jīng)UV檢測(cè)器（測(cè)濃度）、MALS檢測(cè)器（測(cè)光散射）和示差折光檢測(cè)器（dn/dc）。
  - 通過(guò)ASTRA等軟件直接計(jì)算絕對(duì)分子量及分布。

4. 質(zhì)譜分析（以MALDI-TOF為例）：
  - 樣品與基質(zhì)（如芥子酸）混合點(diǎn)靶。
  - 激光轟擊電離，TOF分析器根據(jù)m/z值分離離子。
  - 通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品或理論值比對(duì)確定分子量。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)需遵循國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或指南以確保結(jié)果可靠性：

1. 國(guó)際/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：
- ISO 13485：醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系，對(duì)原材料（如膠原蛋白）的測(cè)試要求有指導(dǎo)意義。
- 《中華人民共和國(guó)藥典》（ChP）：相關(guān)生物制品或輔料的檢定通則。

2. 方法標(biāo)準(zhǔn)：
- GB/T 34800-2017《蛋白質(zhì)定量質(zhì)譜通則》：規(guī)范質(zhì)譜法定量分析蛋白質(zhì)的流程。
- YY/T 0606.25-2014《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第25部分：動(dòng)物源性生物材料膠原蛋白表征》或類(lèi)似標(biāo)準(zhǔn)：詳細(xì)規(guī)定膠原蛋白分子量、純度等指標(biāo)的檢測(cè)方法（常推薦SDS-PAGE、HPLC）。

3. 核心參數(shù)要求（示例）：
  - 分子量：完整I型膠原蛋白應(yīng)在280-320 kDa范圍內(nèi)；α鏈在95-100 kDa。
  - 純度：目標(biāo)條帶占比通常要求≥95%（通過(guò)SDS-PAGE或HPLC峰面積積分）。
  - 降解限度：低分子量雜質(zhì)（如 <50 kDa）含量需低于規(guī)定閾值（如5%）。

選擇合適的檢測(cè)手段需綜合考慮精度需求、樣品特性、設(shè)備可用性及成本。SDS-PAGE經(jīng)濟(jì)便捷，適合常規(guī)質(zhì)控；SEC-MALS和質(zhì)譜法則提供更高精度和絕對(duì)分子量信息，是深入研究與高端產(chǎn)品放行的關(guān)鍵依據(jù)。嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)是保證檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性與可比性的基石。