空斑形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)檢測(cè)
空斑形成細(xì)胞測(cè)定（Plaque-Forming Cell Assay, PFC Assay），也稱為溶血空斑試驗(yàn)（Hemolytic Plaque Assay），是免疫學(xué)研究中一項(xiàng)經(jīng)典的體外檢測(cè)技術(shù)，主要用于定量檢測(cè)能夠分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞。該試驗(yàn)基于抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性紅細(xì)胞溶解原理：當(dāng)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞（ASC）分泌的抗體與其周圍的綿羊紅細(xì)胞（SRBC，通常作為抗原）結(jié)合，并在補(bǔ)體存在的情況下，會(huì)導(dǎo)致局部的紅細(xì)胞溶解，從而在瓊脂糖或其它半固體培養(yǎng)基中形成肉眼可見的透明溶解區(qū)域，即“空斑”（Plaque）。每一個(gè)空斑通常代表一個(gè)能分泌特異性抗體的活性B細(xì)胞或漿細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)空斑數(shù)量即可推算出樣品中抗原特異性抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量和功能。該方法靈敏度高，可直接反映機(jī)體的體液免疫應(yīng)答狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于疫苗效力評(píng)估、免疫調(diào)節(jié)劑研究、自身免疫性疾病研究、過敏研究以及基礎(chǔ)免疫學(xué)研究等領(lǐng)域。
檢測(cè)項(xiàng)目
空斑形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)的核心檢測(cè)項(xiàng)目是：
抗原特異性抗體分泌細(xì)胞（Antibody-Secreting Cells, ASCs）的數(shù)量與活性。具體包括：
1. 總IgM/IgG/IgA分泌細(xì)胞數(shù)量： 通常使用非特異性刺激物（如LPS）或抗免疫球蛋白抗體包被的紅細(xì)胞來檢測(cè)分泌各類免疫球蛋白的B細(xì)胞總數(shù)，反映B細(xì)胞的整體功能狀態(tài)。
2. 特異性抗體分泌細(xì)胞數(shù)量： 使用特定的抗原（如SRBC、卵白蛋白OVA、病毒蛋白等）致敏或包被的紅細(xì)胞，檢測(cè)針對(duì)該特定抗原產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞數(shù)量，直接評(píng)估針對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度。
3. 空斑形成單位（Plaque-Forming Units, PFU）： 對(duì)空斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常以每百萬個(gè)脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞或外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中形成的空斑數(shù)來表示（PFU/10^6 cells）。這是最核心的定量指標(biāo)。
檢測(cè)儀器
進(jìn)行空斑形成細(xì)胞測(cè)定通常需要以下關(guān)鍵儀器和設(shè)備：
1. 生物安全柜/超凈工作臺(tái)： 用于無菌操作，防止細(xì)胞污染。
2. CO2培養(yǎng)箱： 維持恒定的溫度（通常37°C）、濕度和CO2濃度（5%），確保細(xì)胞在培養(yǎng)期間保持活性。
3. 倒置顯微鏡： 用于觀察細(xì)胞狀態(tài)、鋪板均勻性以及初步識(shí)別空斑。配備相機(jī)可進(jìn)行成像記錄。
4. 離心機(jī)： 用于細(xì)胞分離、洗滌和沉淀。
5. 恒溫水浴鍋： 用于融化瓊脂糖并保持其液態(tài)（通常維持在45-48°C）。
6. 微量移液器及配套吸頭： 用于精準(zhǔn)加樣。
7. 培養(yǎng)皿/平皿：
8. 計(jì)數(shù)板（如血球計(jì)數(shù)板）或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器： 用于精確計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。
9. 磁力攪拌器（可選）： 用于在倒瓊脂糖時(shí)混勻細(xì)胞和試劑。
10. 成像分析系統(tǒng)（可選但推薦）： 高分辨率掃描儀或?qū)Ｓ玫目瞻叻治鰞x配合軟件，用于自動(dòng)計(jì)數(shù)空斑并分析大小，提高結(jié)果的客觀性和效率。
檢測(cè)方法
標(biāo)準(zhǔn)的空斑形成細(xì)胞測(cè)定（以檢測(cè)抗SRBC抗體分泌細(xì)胞為例）主要步驟如下：
1. 細(xì)胞懸液制備： 無菌采集免疫動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)或血液，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整至合適濃度（如5-10 x 10^6 cells/mL）。
2. 鋪板：
* 融化適量瓊脂糖（如0.5-0.7%），保持在45-48°C水浴中。
* 將預(yù)熱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如RPMI 1640、MEM）、滅活的胎牛血清（FCS）、細(xì)胞懸液、SRBC懸液（通常0.1-0.2%壓積）以及適量稀釋的補(bǔ)體（如豚鼠血清）快速混合均勻。
* 迅速將混合液傾倒入預(yù)熱的培養(yǎng)皿或平皿中，輕輕搖動(dòng)使其均勻鋪開。
* 待瓊脂糖凝固（室溫或4°C放置數(shù)分鐘）。
3. 溫育： 將鋪好的平皿放入37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間（通常為1-2小時(shí)），讓抗體分泌細(xì)胞釋放抗體，抗體與周圍的SRBC結(jié)合。
4. 補(bǔ)體作用：
* 小心地在已凝固的瓊脂糖層表面覆蓋一層預(yù)熱（37°C）的、適當(dāng)稀釋的補(bǔ)體溶液（如1：10-1：20稀釋的豚鼠血清）。
* 繼續(xù)放入37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45-90分鐘。補(bǔ)體被抗原-抗體復(fù)合物激活，導(dǎo)致結(jié)合了抗體的SRBC溶解，形成空斑。
5. 空斑計(jì)數(shù)：
* 溫育結(jié)束后，取出平皿?？芍苯釉诠鈱W(xué)顯微鏡（低倍鏡，如40x）下肉眼或借助放大鏡觀察計(jì)數(shù)空斑。
* 更精確的方法是使用平板掃描儀掃描整個(gè)平皿，利用圖像分析軟件自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)空斑。每個(gè)清晰的圓形透明溶解區(qū)計(jì)為一個(gè)空斑。
6. 結(jié)果計(jì)算： 根據(jù)鋪板時(shí)的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算每百萬個(gè)細(xì)胞中的空斑形成單位（PFU/10^6 cells）。
檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)
空斑形成細(xì)胞測(cè)定雖然沒有全球統(tǒng)一的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，但其操作和結(jié)果判讀遵循以下關(guān)鍵原則和參考標(biāo)準(zhǔn)：
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化：
* 設(shè)立合適的陰性對(duì)照（如未免疫動(dòng)物細(xì)胞、不加抗原SRBC）、陽性對(duì)照（如已知高反應(yīng)動(dòng)物細(xì)胞）以評(píng)估實(shí)驗(yàn)體系的有效性。
* 細(xì)胞濃度、SRBC濃度、補(bǔ)體濃度和活性、溫育時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)需在預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)中保持一致，并在報(bào)告中詳細(xì)記錄。
2. 試劑質(zhì)量控制：
* SRBC： 新鮮采集或商業(yè)購買，使用前洗滌并配制準(zhǔn)確濃度。批次差異可能影響結(jié)果，需注意。
* 補(bǔ)體： 豚鼠血清是最常用來源。必須新鮮或正確保存（-70°C以下），使用前需滴定其最適溶血活性濃度（通常要求1：10稀釋時(shí)能完全溶血），并在當(dāng)次實(shí)驗(yàn)中滅活處理不當(dāng)批次或過度稀釋可能無活性。每次實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行活性測(cè)試。
* 培養(yǎng)基與血清： 保證無菌、無支原體污染，血清需滅活。
3. 空斑判讀標(biāo)準(zhǔn)：
* 空斑應(yīng)為清晰、圓形、邊緣銳利的透明區(qū)域，中心可見淋巴細(xì)胞（即形成該空斑的ASC）。
* 排除因氣泡、雜質(zhì)或非特異性溶血造成的假陽性。
* 對(duì)于模糊邊緣或不規(guī)則形狀的空斑，是否計(jì)數(shù)需在實(shí)驗(yàn)方案中預(yù)先明確規(guī)定并保持一致。
* 計(jì)數(shù)時(shí)通常選擇空斑分布均勻、數(shù)量適中的區(qū)域或計(jì)數(shù)整個(gè)平皿。
4. 結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：
* 結(jié)果應(yīng)以 PFU/10^6 cells ± SD/SEM 的形式報(bào)告。
* 報(bào)告中必須包含詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)條件：動(dòng)物品系、免疫方案（抗原、劑量、途徑、時(shí)間）、細(xì)胞來源（脾、淋巴結(jié)、PBMC）、細(xì)胞濃度、SRBC濃度、補(bǔ)體來源/批次/稀釋度、溫育時(shí)間、計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)/平皿數(shù)/區(qū)域等。
5. 參考方法學(xué)文獻(xiàn)： 該方法的建立和優(yōu)化常參考經(jīng)典免疫學(xué)著作和權(quán)威期刊發(fā)表的詳細(xì)Protocol，如Jerne和Nordin在1963年首次描述的方法及其后續(xù)的各種改良版本。
注意事項(xiàng)： 該方法操作步驟較多，技術(shù)要求較高，特別是鋪板的均勻性、補(bǔ)體的活性和溫育時(shí)間的控制對(duì)結(jié)果影響很大。實(shí)驗(yàn)者需要經(jīng)過訓(xùn)練并注意細(xì)節(jié)控制，確保結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。自動(dòng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)可顯著提高效率和客觀性。
CMA認(rèn)證
檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號(hào)：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書
證書編號(hào)：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號(hào)：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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