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蠶微粒子病檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-21 01:52:30 更新時(shí)間：2025-07-20 01:52:30

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

蠶微粒子病檢測：保障蠶種健康與產(chǎn)業(yè)安全的關(guān)鍵

蠶微粒子病是由原生動物Nosema bombycis（家蠶微孢子蟲）引起的一種毀滅性、傳染性極強(qiáng)的蠶病，是蠶業(yè)生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。該病主要通過食下傳染（被孢子污染的桑葉）和經(jīng)卵傳染（帶病母蛾產(chǎn)下的卵攜帶孢子）兩種途徑傳播。經(jīng)卵傳染的危害尤為嚴(yán)重，它會導(dǎo)致帶病蠶卵孵化出的次代蠶全部感染發(fā)病，造成整批蠶作失敗，給蠶種生產(chǎn)和蠶繭收成帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對蠶種，特別是種繭育母蛾、制種用蠶卵進(jìn)行嚴(yán)格的微粒子病檢測和檢疫，是蠶種生產(chǎn)、經(jīng)營、流通環(huán)節(jié)中不可或缺的核心技術(shù)環(huán)節(jié)，是保障蠶種無毒、健康，維護(hù)蠶桑產(chǎn)業(yè)安全穩(wěn)定發(fā)展的基石。

檢測項(xiàng)目

蠶微粒子病檢測的核心項(xiàng)目就是檢測樣品中是否存在Nosema bombycis孢子。具體檢測對象通常包括：

1. 母蛾檢測： 這是最常用、最關(guān)鍵的檢測方式。在種繭育中，蠶蛾羽化交配產(chǎn)卵后，收集母蛾個(gè)體或其研磨液進(jìn)行檢測。
2. 蠶卵檢測： 對即將用于制種的蠶卵或待出售的蠶種進(jìn)行抽樣檢測（常采用卵殼檢測法）。
3. 蠶體、蠶糞檢測： 在飼育過程中對疑似病蠶、遲眠蠶或蠶糞進(jìn)行檢測，用于早期預(yù)警和病害調(diào)查。

檢測儀器

蠶微粒子病檢測主要依賴于光學(xué)顯微鏡觀察，所需的關(guān)鍵儀器設(shè)備包括：

1. 光學(xué)顯微鏡： 必備的核心設(shè)備。通常要求配備油鏡鏡頭，以便在1000倍左右的放大倍率下清晰觀察孢子的形態(tài)特征。
2. 研磨器具： 用于將母蛾、蠶卵（卵殼）或組織樣品研磨破碎，釋放孢子。常用研缽和研杵（玻璃或陶瓷制）、小型組織研磨儀或帶研磨球的離心管。
3. 離心機(jī)： 用于對研磨液進(jìn)行離心，濃縮孢子，提高檢出率。
4. 載玻片和蓋玻片： 用于制作顯微鏡檢標(biāo)本。
5. 微量移液器及槍頭： 用于精確移取研磨液或孢子懸浮液。
6. 天平： 用于精確稱量樣品。
7. 計(jì)數(shù)器： 用于記錄觀察視野數(shù)和發(fā)現(xiàn)的孢子數(shù)。

（注： 雖然PCR、LAMP等分子生物學(xué)方法靈敏度更高，特異性更好，但在蠶種生產(chǎn)的大規(guī)模常規(guī)檢疫中，因成本、效率及傳統(tǒng)習(xí)慣，顯微鏡檢法仍是主流和法定方法。）

檢測方法

目前蠶種生產(chǎn)上普遍采用且被國家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的主要方法是母蛾集團(tuán)磨蛾顯微鏡檢法：

1. 樣品制備：

集團(tuán)劃分： 將一定數(shù)量（通常28頭或25頭）的母蛾個(gè)體組成一個(gè)檢驗(yàn)集團(tuán)。
磨蛾： 將同一集團(tuán)的母蛾放入研磨器具中，加入適量（如1ml）的蒸餾水或0.85%生理鹽水、0.6% K₂CO₃溶液（有助于分散孢子團(tuán)塊），充分研磨成均勻的懸濁液。
離心（可選）： 研磨液可進(jìn)行低速離心（如1500-3000 rpm, 5分鐘），棄去部分上清，濃縮底部沉淀物，提高孢子濃度。

2. 鏡檢：

用微量移液器吸取適量研磨液（或濃縮液）滴于潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片。
置于光學(xué)顯微鏡下，先用低倍鏡（如100倍）瀏覽查找可疑物，再用高倍鏡（400倍）仔細(xì)辨認(rèn)，最后在油鏡（1000倍）下進(jìn)行最終確認(rèn)。
Nosema bombycis孢子呈卵圓形，大小約3-4 μm × 1.5-2.0 μm，具有強(qiáng)烈的折光性，邊緣清晰，內(nèi)部有時(shí)可見空泡或極絲盤繞結(jié)構(gòu)（油鏡下較清晰）。

3. 結(jié)果判定： 在載玻片上系統(tǒng)檢查一定數(shù)量的視野（通常要求至少2個(gè)蓋玻片區(qū)域，每個(gè)區(qū)域檢查不少于30個(gè)視野）。只要在一個(gè)檢驗(yàn)集團(tuán)的樣品中發(fā)現(xiàn)1粒及以上形態(tài)典型的Nosema bombycis孢子，即可判定該集團(tuán)為陽性（帶毒）。

其他方法：

單蛾磨蛾鏡檢法： 對每頭母蛾單獨(dú)研磨檢查，精度最高但工作量巨大，常用于復(fù)檢或研究。
卵殼檢驗(yàn)法： 用一定濃度的堿液（如NaOH）溶解一定數(shù)量蠶卵的卵殼（溶解卵內(nèi)容物），離心收集卵殼碎片和可能附著的孢子進(jìn)行鏡檢。
分子生物學(xué)檢測法（PCR/LAMP）： 提取樣品DNA，利用特異性引物擴(kuò)增微孢子蟲的特異性基因片段（如SSU rRNA基因），通過電泳或熒光信號判斷結(jié)果。此法靈敏度、特異性極高，但成本較高，操作更復(fù)雜，常用于特定要求或科研。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

我國蠶微粒子病檢測嚴(yán)格遵循國家標(biāo)準(zhǔn)：

國家標(biāo)準(zhǔn)： GB/T 19177-2003 《桑蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程》

該標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了桑蠶一代雜交種的質(zhì)量要求、檢驗(yàn)方法（核心是母蛾集團(tuán)磨蛾鏡檢法）和檢驗(yàn)規(guī)則。
抽樣方法： 規(guī)定了不同蠶種生產(chǎn)批次的抽樣蛾數(shù)和集團(tuán)數(shù)。
合格判定： 該標(biāo)準(zhǔn)的核心要求是：經(jīng)檢驗(yàn)，蠶種的母蛾微粒子病檢出率不得超過0.5%（即平均每200個(gè)檢驗(yàn)集團(tuán)中陽性集團(tuán)數(shù)不得超過1個(gè)）。否則判定為不合格蠶種，禁止流通和使用。
對檢驗(yàn)程序、研磨液制備、鏡檢要求（視野數(shù)、孢子確認(rèn)）、結(jié)果記錄與報(bào)告等都有詳細(xì)規(guī)定。

其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)： 針對蠶種生產(chǎn)的不同環(huán)節(jié)和原種，還有如GB/T 19178-2003《桑蠶原種檢驗(yàn)規(guī)程》等標(biāo)準(zhǔn)，其核心檢測方法與合格標(biāo)準(zhǔn)與一代雜交種相似，但抽樣方案可能有差異。

總結(jié)： 蠶微粒子病檢測是蠶種安全生產(chǎn)的生命線，以母蛾集團(tuán)磨蛾顯微鏡檢法為主流，依據(jù)GB/T 19177-2003等國家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。通過標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的檢測程序，嚴(yán)格控制帶毒蠶種流入生產(chǎn)環(huán)節(jié)，對預(yù)防該病的大規(guī)模流行、保障蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。隨著技術(shù)進(jìn)步，分子生物學(xué)檢測方法也在逐步應(yīng)用和推廣，有望為微粒子病防控提供更精準(zhǔn)、更高效的技術(shù)支撐。