凝固酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和其它種）檢測

凝固酶陽性葡萄球菌，尤其是其中的金黃色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*），是重要的食源性致病菌和醫(yī)療相關(guān)感染的主要病原體之一。它們廣泛存在于環(huán)境、人體皮膚和鼻腔中，能夠產(chǎn)生多種毒素（如腸毒素、溶血毒素）和侵襲性酶（如凝固酶、耐熱核酸酶）。攝入被金黃色葡萄球菌腸毒素污染的食物會導(dǎo)致急性食物中毒，表現(xiàn)為劇烈嘔吐、腹瀉等癥狀。此外，金黃色葡萄球菌也是皮膚軟組織感染、肺炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合征等嚴(yán)重疾病的重要病因。某些凝固酶陽性的非金黃色葡萄球菌（如施氏葡萄球菌凝聚亞種、中間葡萄球菌等）也被證明具有致病潛力，尤其在動物和人類機(jī)會性感染中。因此，準(zhǔn)確、及時地檢測和鑒定食品、環(huán)境樣本、臨床標(biāo)本中的凝固酶陽性葡萄球菌，特別是金黃色葡萄球菌，對于保障食品安全、控制醫(yī)院感染和指導(dǎo)臨床治療具有極其重要的意義。

檢測項目

凝固酶陽性葡萄球菌檢測的核心目標(biāo)包括：

• 定性檢測：確定樣品中是否存在凝固酶陽性葡萄球菌（主要是金黃色葡萄球菌）。
• 定量檢測：測定樣品（如食品）中凝固酶陽性葡萄球菌（主要是金黃色葡萄球菌）的數(shù)量（通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示）。
• 鑒定：將檢出的凝固酶陽性葡萄球菌進(jìn)一步鑒定到種（如區(qū)分金黃色葡萄球菌與其他凝固酶陽性葡萄球菌）。
• 特定毒素檢測：有時需要額外檢測金黃色葡萄球菌是否產(chǎn)生腸毒素（SEs）或耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）相關(guān)的 mecA/mecC 基因。

檢測儀器

檢測過程中可能使用到以下儀器設(shè)備：

• 基礎(chǔ)實驗室設(shè)備：生物安全柜（用于無菌操作）、恒溫培養(yǎng)箱（用于樣本孵育）、恒溫水浴鍋（用于凝固酶試驗）、冰箱/冰柜（用于培養(yǎng)基和試劑保存）、高壓蒸汽滅菌器（用于器材滅菌）、天平、均質(zhì)器/拍擊式均質(zhì)袋（用于樣品前處理）。
• 分離與計數(shù)設(shè)備：接種環(huán)/針、涂布棒、菌落計數(shù)器（用于平板菌落計數(shù)）。
• 生化鑒定設(shè)備：顯微鏡（用于形態(tài)觀察）、生化鑒定管或微量生化反應(yīng)板、藥敏試驗系統(tǒng)。
• 分子生物學(xué)儀器（用于快速鑒定或毒素/耐藥基因檢測）：PCR儀、實時熒光定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。
• 自動化/快速檢測系統(tǒng)：如基于免疫學(xué)方法（ELISA、膠體金試紙條）或分子生物學(xué)（如恒溫擴(kuò)增）的快速檢測試劑盒及其配套讀取設(shè)備；全自動或半自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（如VITEK, BD Phoenix, MALDI-TOF MS）。

檢測方法

檢測方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法和快速檢測法：

1. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法（標(biāo)準(zhǔn)方法）：
   • 前處理與增菌：樣品經(jīng)無菌均質(zhì)后，根據(jù)檢測目的（定性或定量）選擇直接涂布或先進(jìn)行選擇性增菌（如使用7.5%氯化鈉肉湯或BHI肉湯）。
   • 分離培養(yǎng)：增菌液或均質(zhì)液劃線接種到選擇性平板（最常用Baird-Parker瓊脂平板，典型菌落為圓形、黑色、邊緣光滑濕潤、外圍有一混濁帶和透明圈）。也可使用血瓊脂平板（觀察溶血環(huán)）或顯色培養(yǎng)基（如金黃色葡萄球菌顯色平板）。
   • 純培養(yǎng)與初步鑒定：挑取典型或可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭氏染色（觀察革蘭氏陽性球菌，葡萄狀排列）、觸酶試驗（陽性）。
   • 凝固酶試驗（關(guān)鍵鑒定試驗）：這是區(qū)分凝固酶陽性（致病性強(qiáng)）和凝固酶陰性葡萄球菌的核心試驗。
     • 玻片法（結(jié)合凝固酶試驗）：檢測菌體表面結(jié)合的凝固酶，快速但存在假陽性和假陰性，需試管法確證。
     • 試管法（游離凝固酶試驗）：將純培養(yǎng)菌落接種于含兔血漿（含EDTA抗凝劑）的試管中，置于37°C水浴或培養(yǎng)箱中孵育。觀察4小時和24小時。陽性結(jié)果：血漿凝固成膠凍狀，即使試管倒置或傾斜也不會流動。陰性結(jié)果：血漿保持液態(tài)。試管法是鑒定凝固酶陽性葡萄球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。
   • 耐熱核酸酶試驗：常作為金黃色葡萄球菌的輔助鑒定指標(biāo)（大多數(shù)金葡菌陽性）。
   • 定量計數(shù)：選擇合適的稀釋度，涂布于選擇性平板（如Baird-Parker），計數(shù)典型菌落，并確證凝固酶陽性，計算樣品中的含量。
   • 進(jìn)一步鑒定：對于凝固酶陽性的菌株，可通過API Staph、VITEK GP卡等生化鑒定系統(tǒng)或MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定到種。
2. 快速檢測法：
   • 免疫學(xué)方法：利用金黃色葡萄球菌特異性抗體（如針對蛋白A、腸毒素或表面抗原）進(jìn)行檢測，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、側(cè)向?qū)游雒庖咴嚰垪l（膠體金法），主要用于初篩或腸毒素檢測。
   • 分子生物學(xué)方法：主要是PCR及實時熒光定量PCR技術(shù)，通過擴(kuò)增金黃色葡萄球菌特異性基因片段（如耐熱核酸酶基因 *nuc*、23S rRNA基因片段或其他特異性標(biāo)記基因）進(jìn)行快速、靈敏的定性或定量檢測。也可用于檢測腸毒素基因（*sea, seb*等）或mecA/c基因（鑒定MRSA）。
   • 自動化儀器法：如全自動微生物鑒定系統(tǒng)（利用生化反應(yīng)）或MALDI-TOF MS（利用蛋白質(zhì)指紋圖譜）可在更短時間內(nèi)提供鑒定結(jié)果。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

國內(nèi)外針對凝固酶陽性葡萄球菌（主要是金黃色葡萄球菌）的檢測制定了多項標(biāo)準(zhǔn)，以保證檢測的準(zhǔn)確性和可比性：

• 中國國家標(biāo)準(zhǔn) (GB)：
  • GB 4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》：這是國內(nèi)食品檢測的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的定性（包括增菌法）和定量（平板計數(shù)法）檢測程序、培養(yǎng)基、鑒定步驟（包括凝固酶試驗）及結(jié)果報告。
  • GB/T 7918.5-1987 《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 金黃色葡萄球菌》：規(guī)定了化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗方法。（注：可能有更新版本或?qū)⒈恍聡鴺?biāo)替代）。
  • 臨床檢驗領(lǐng)域：遵循衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或由權(quán)威機(jī)構(gòu)（如中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會）發(fā)布的指南，對臨床標(biāo)本（如血液、膿液、分泌物）中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測和藥敏試驗。
• 國際標(biāo)準(zhǔn) (ISO)：
  • ISO 6888-1:2021 《Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (*Staphylococcus aureus* and other species) -- Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium》：規(guī)定了使用Baird-Parker瓊脂進(jìn)行凝固酶陽性葡萄球菌計數(shù)的國際標(biāo)準(zhǔn)方法。
  • ISO 6888-2:2021 《... Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium》：規(guī)定了使用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養(yǎng)基的計數(shù)方法。
  • ISO 6888-3:2003 《... Part 3: Detection and MPN technique for low numbers》：規(guī)定了低數(shù)量時凝固酶陽性葡萄球菌的檢測和最可能數(shù)（MPN）技術(shù)。
  • ISO 22718:2015 《Cosmetics -- Microbiology -- Detection of *Staphylococcus aureus*》：規(guī)定了化妝品中金黃色葡萄球菌檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)方法。
• 美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) / 美國分析化學(xué)家協(xié)會 (AOAC)

  檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)證書

  

  CMA認(rèn)證

  檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書

  證書編號：241520345370

  有效期至：2030年4月15日

  

  CNAS認(rèn)可

  實驗室認(rèn)可證書

  證書編號：CNAS L22006

  有效期至：2030年12月1日

  

  ISO認(rèn)證

  質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書

  證書編號：ISO9001-2024001

  有效期至：2027年12月31日