利用C57BL/6J小鼠制備肺纖維化模型。

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
C57BL/6J小鼠45 只（SPF 級(jí)），體重20--22g，10-12周，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司〔動(dòng)物合格證：SCXK（京）2015-0035〕，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物房屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，溫度為20-26℃，相對(duì)濕度50%-60%。

3.2試劑 
博來(lái)霉素（BLM）：注射用鹽酸博來(lái)霉素，日本化藥株式會(huì)社；鹽酸氯胺酮注射液：沈陽(yáng)市獸藥廠，獸藥字（2011）060022668；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天；核固紅染色液（0.5%）：北京雷根生物技術(shù)有限公司。

3.3模型建立
14周齡的雄性小鼠按體重隨機(jī)分為未處理組（n=5）和處理組（n=40），處理組氣管滴注BLM溶液（0.4 mg/ ml，每只100ul），未處理組小鼠不經(jīng)任何處理，處理組小鼠用注射用鹽酸氯胺酮150mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露聲門，用接套管的1ml注射器氣道給藥。兩星期給藥一次，給藥8次，第一次給藥為0周，在0.5個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)分別取肺組織，稱重，取右肺中葉做冰凍切片，剩余肺組織10%中性甲醛中固定制備石蠟切片做HE染色、Masson染色。

3.4 HE染色
肺組織10%中性甲醛中固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切片5um，進(jìn)行蘇木素—伊紅染色，普通光學(xué)顯微鏡（BX50，Olympus, Japan）下觀察肺組織病理學(xué)改變，病理學(xué)鏡檢人員進(jìn)行單盲評(píng)分。

3.5 Masson染色 
肺組織石蠟切片脫蠟，蒸餾水沖洗，Masson染色復(fù)合液染色5min，自來(lái)水沖洗，0.2%醋酸浸洗，自來(lái)水沖洗，1%磷鎢酸，水洗后亮綠染色液染色15min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻，脫水、透明、固封。

3.6 肺系數(shù)
小鼠在BLM處理0.5個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取肺組織，稱重，計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺組織重量（mg）/小鼠體重（g）。

3.7 冰凍切片 
小鼠在0.5個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取右肺中葉，速凍后，將肺組織浸沒在適量的包埋劑中，用冰凍組織切片機(jī)制作8um的切片。

3.8 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法 
肺組織冰凍切片按試劑盒說(shuō)明操作。先用試劑盒中固定液固定15min，PBS洗3次，每次3min，配置染色液，滴加到冰凍切片上，37℃培養(yǎng)箱（無(wú)CO₂）過(guò)夜后，PBS洗一遍，核固紅（0.5%）復(fù)染15min，使細(xì)胞核變?yōu)榧t色，便于區(qū)分細(xì)胞。

3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，多組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。