C57BL/6小鼠

一、模型設(shè)計原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實現(xiàn)Drd5基因條件性敲除的目的。實驗采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

根據(jù)Drd5基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)分析可知：Exon2（aa1-478）為公共外顯子，位于蛋白功能保守區(qū)上：7tm_GPCRs superfamily domain，條件性刪除這個外顯子后，將破壞7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此決定在Exon1的兩邊定點插入FloxP位點，實現(xiàn)將Exon1條件性敲除。

1）GRNA靶點設(shè)計及活性檢測

在要刪除的Exon1外顯子兩端，設(shè)計gRNA靶點如下

使用Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒（貨號：VK007）進(jìn)行g(shù)RNA體外活性檢測，結(jié)果如下：

gRNA靶點活性檢測結(jié)果

靶點活性數(shù)據(jù)分析如下：

根據(jù)活性檢測結(jié)果，我們選用活性最高的L2,R1進(jìn)行F0代首建鼠構(gòu)建。

2）PCR結(jié)果分析

使用如下引物進(jìn)行目的條帶擴(kuò)增 

M-CKO-M30 (1-19,NC)目的帶擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如下圖： 

M：BM2000 Marker，如右圖所示

NC:陰性對照

如圖所示，5♂擴(kuò)出目的條帶

3）Drd5^floxp/flox小鼠測序結(jié)果分析

以M-CKO-M30-5小鼠測序結(jié)果為例，測序結(jié)果標(biāo)注如下：