壓力蒸汽滅菌生物指示劑的性能檢測

壓力蒸汽滅菌是醫(yī)療、制藥和實驗室領域應用最廣泛的滅菌方法之一。生物指示劑（Biological Indicators, BIs）內含高度標準化的、對滅菌劑具有特定抗力的微生物（通常為嗜熱脂肪地芽孢桿菌的芽孢），是監(jiān)測和驗證壓力蒸汽滅菌過程有效性的“金標準”。為確保生物指示劑結果的準確性和可靠性，必須對其關鍵性能參數(shù)進行嚴格檢測。

一、核心性能參數(shù)及其重要性

1. 芽孢含量（Viable Spore Count/Viable Count）：

   • 定義： 指單個生物指示劑載體（如紙條、孢子懸液或自含式小瓶）上存活的嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的數(shù)量（通常以CFU，菌落形成單位表示）。
   • 重要性： 是計算其他關鍵參數(shù)（如D值和存活/殺滅時間）的基礎。芽孢數(shù)量過低會降低指示劑的靈敏度；過高則可能超出滅菌過程的殺滅能力范圍，導致假陽性（滅菌失?。?。
   • 檢測方法：
     • 定量培養(yǎng)法： 將指示劑置于中和劑或滅菌水中充分震蕩洗脫芽孢，進行系列梯度稀釋。
     • 傾注平板法/涂布平板法： 將稀釋后的芽孢懸液接種到適宜的固體培養(yǎng)基（如胰酪胨大豆瓊脂TSA）表面或傾注混合。
     • 培養(yǎng)與計數(shù)： 在56±1℃下培養(yǎng)，通常在24小時初步觀察，48小時或更長時間（如7天）后計數(shù)典型菌落。結果需乘以稀釋倍數(shù)得出原始指示劑上的總芽孢數(shù)。需平行測試多個指示劑（如≥10個）以獲得可靠的平均值和變異范圍。

2. D值（Decimal Reduction Value）：

   • 定義： 在特定滅菌條件下（特定溫度、介質），殺滅90%（即減少1個對數(shù)單位）目標微生物群體所需的時間（單位：分鐘）。
   • 重要性： 衡量芽孢對滅菌劑抗力的核心指標。D值是確定滅菌程序參數(shù)（如滅菌時間）和驗證生物指示劑性能的關鍵依據(jù)。
   • 檢測方法（部分殺滅法）：
     • 抗力檢測儀（Resistometer）： 使用專門的設備，能在精確控制的滅菌溫度（如121℃或132℃）下對生物指示劑進行一系列不同且精確的暴露時間處理。
     • 暴露與培養(yǎng)： 將多組生物指示劑（每組≥20個）分別暴露于一系列遞增的、相對較短的滅菌時間下（旨在達到不同程度的殺滅，如存活芽孢數(shù)在10^0 - 10^5 CFU之間）。
     • 芽孢回收培養(yǎng)： 按規(guī)定方法回收并培養(yǎng)存活的芽孢。
     • 計算： 繪制暴露時間（分鐘）對存活芽孢數(shù)對數(shù)（log?? CFU）的曲線圖。D值即為存活曲線直線部分（對數(shù)殺滅期）斜率的負倒數(shù)。需使用統(tǒng)計方法（如最大似然估計）進行準確計算。

3. 存活時間（Survival Time - ST）與殺滅時間（Kill Time - KT）：

   • 定義：
     • 存活時間（ST）： 在特定滅菌條件下，所有測試生物指示劑（通常每組≥50個）經(jīng)暴露處理后，經(jīng)培養(yǎng)均呈陽性（有菌生長）的最短暴露時間。
     • 殺滅時間（KT）： 在特定滅菌條件下，所有測試生物指示劑經(jīng)暴露處理后，經(jīng)培養(yǎng)均呈陰性（無菌生長）的最短暴露時間。
   • 重要性： ST和KT提供了在實際滅菌周期驗證中，生物指示劑預期表現(xiàn)（陽性/陰性）的時間窗口范圍，是滅菌程序設定和日常監(jiān)測的重要參考。理想狀態(tài)下，ST > KT_min（滅菌程序設定的最短滅菌時間），KT < KT_max（滅菌程序設定的最長滅菌時間）。
   • 檢測方法：
     • 使用抗力檢測儀在規(guī)定的滅菌溫度下進行暴露。
     • 每組≥50個生物指示劑暴露于一系列選定的時間點（時間點設計需覆蓋預期的ST和KT）。
     • 按規(guī)定方法進行培養(yǎng)（通常56±1℃，7天）。
     • ST定義為所有指示劑均為陽性的最大暴露時間。
     • KT定義為所有指示劑均為陰性的最小暴露時間。
     • 結果需報告達到ST和KT所需的暴露時間（分鐘）。

4. 純度培養(yǎng)（Culture Purity）：

   • 檢測目的： 確認生物指示劑中只含有規(guī)定的嗜熱脂肪地芽孢桿菌，無其他微生物污染。
   • 檢測方法： 將未經(jīng)滅菌處理的生物指示劑（或從中洗脫的芽孢懸液）接種到非選擇性培養(yǎng)基（如TSA）和選擇性培養(yǎng)基上。在30-35℃和56±1℃兩個溫度下分別培養(yǎng)（通常7天）。觀察是否有除目標芽孢菌落以外的其他菌落形態(tài)生長。應無污染。

二、培養(yǎng)條件與判定

• 培養(yǎng)基： 使用驗證過的、適合嗜熱脂肪地芽孢桿菌生長的專用液體或固體培養(yǎng)基（如胰酪胨大豆肉湯TSB用于自含式，TSA用于傾注/涂布）。
• 培養(yǎng)溫度： 嚴格控制在56±1℃（嗜熱脂肪地芽孢桿菌的最適生長溫度）。
• 培養(yǎng)時間：
  • 陽性結果判定： 自含式指示劑通常在培養(yǎng)24-48小時內可觀察到明顯的培養(yǎng)基顏色變化（如紫色變黃色）。
  • 陰性結果最終判定： 培養(yǎng)時間需足夠長以確保微弱生長的檢出，通常為7天。標準要求培養(yǎng)7天后無生長方可判為陰性。
• 陽性與陰性對照：
  • 陽性對照： 每次培養(yǎng)試驗必須包含未經(jīng)滅菌處理的同批次生物指示劑，以確認培養(yǎng)系統(tǒng)的有效性（必須陽性）。
  • 陰性對照： 應包含無菌培養(yǎng)基（或模擬處理的指示劑），以確認無菌操作和無污染（必須陰性）。

三、檢測頻次與質量控制

• 出廠檢測： 制造商必須在每批產(chǎn)品出廠前完成上述關鍵性能參數(shù)（芽孢含量、D值、ST/KT、純度培養(yǎng)）的全項檢測，確保符合產(chǎn)品標簽聲明和相關標準（如ISO 11138-1, ISO 11138-3）的要求。
• 用戶抽檢/驗證： 使用機構可根據(jù)自身質量體系要求，對接收的生物指示劑進行抽檢（如芽孢含量、純度培養(yǎng)），特別是用于關鍵滅菌驗證時。
• 穩(wěn)定性監(jiān)測： 制造商需通過加速老化或實時老化試驗，持續(xù)監(jiān)測產(chǎn)品在有效期內（標注的儲存條件下）的性能穩(wěn)定性（主要是芽孢含量和抗力），確保在有效期內始終符合要求。

四、注意事項

• 標準遵循： 所有檢測程序必須嚴格遵循國際和國家標準（如ISO 11138系列、GB 18281系列）以及制造商提供的說明書進行操作。
• 設備校準: 抗力檢測儀、培養(yǎng)箱、移液器等關鍵設備必須經(jīng)過定期校準和維護，確保測試條件的精確性和重現(xiàn)性。
• 人員資質： 操作人員需經(jīng)過專業(yè)培訓，具備微生物學和無菌操作知識。
• 結果解讀： 生物指示劑培養(yǎng)結果（陽性/陰性）必須結合滅菌循環(huán)參數(shù)記錄（溫度、壓力、時間）共同分析，才能對滅菌過程的有效性做出準確判斷。
• 存儲與運輸： 生物指示劑的性能受存儲條件（溫度、濕度）和運輸過程影響。必須始終按照制造商說明進行儲存和運輸，避免過熱、過冷或過度潮濕。

結論：

對壓力蒸汽滅菌生物指示劑進行全面的性能檢測是其作為滅菌過程驗證可靠工具的根本保障。通過對芽孢含量、D值、存活時間、殺滅時間和純度培養(yǎng)等核心參數(shù)的嚴格測試與控制，確保了生物指示劑具有規(guī)定的、穩(wěn)定的抗力特性，能夠在特定的滅菌條件下提供一致、可靠的陽性或陰性結果。嚴格遵守檢測標準和操作規(guī)程，是維護滅菌安全、保障醫(yī)療用品和藥品無菌狀態(tài)的關鍵環(huán)節(jié)。

常見QA：

1. Q：如果陽性對照沒有生長怎么辦？
   A： 陽性對照不長表明整個培養(yǎng)系統(tǒng)失效（如培養(yǎng)基失效、培養(yǎng)溫度錯誤、設備故障）。該次測試結果無效，必須調查原因并重新進行測試。
2. Q：生物指示劑的芽孢含量會變化嗎？
   A： 是的。芽孢含量會隨著時間推移（即使在有效期內）和不當?shù)膬Υ鏃l件（如高溫、高濕）而衰減。制造商通過穩(wěn)定性測試確定有效期。用戶應關注有效期并按要求儲存。
3. Q：D值檢測為什么用部分殺滅法而不是單點測試？
   A： 單點測試（如在121℃暴露固定時間）只能驗證該時間點的殺滅效果，無法準確量化芽孢抗力（D值）。部分殺滅法通過多點測試繪制存活曲線，能精確計算出D值，反映芽孢抗力的本質屬性。