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殺滅微生物試驗（枯草桿菌黑色變種芽孢、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌）檢測

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發(fā)布時間：2025-08-02 14:46:33 更新時間：2025-08-01 14:46:34

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

殺滅微生物試驗（枯草桿菌黑色變種芽孢、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌）檢測

殺滅微生物試驗（枯草桿菌黑色變種芽孢、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌）檢測

殺滅微生物試驗是評價消毒劑、滅菌劑及抗菌產(chǎn)品對特定微生物殺滅效果的關(guān)鍵檢測項目，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、日化、食品及公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。本試驗重點針對具有不同生物學(xué)特性和抗性的典型指示微生物：枯草桿菌黑色變種芽孢（Bacillus subtilis var. niger spores，代表高抗力細(xì)菌芽孢）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，代表革蘭氏陽性球菌）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，代表革蘭氏陰性桿菌）和白色念珠菌（Candida albicans，代表致病性酵母菌）。通過對這四種微生物的殺滅效果評估，可以綜合反映待測產(chǎn)品的廣譜殺菌能力、作用強(qiáng)度以及對不同類別微生物的殺滅效率，為產(chǎn)品性能驗證和安全性評價提供重要科學(xué)依據(jù)。

檢測項目

本試驗的核心檢測項目包括：

殺菌率/殺滅對數(shù)值計算：定量測定在規(guī)定作用時間和條件下，待測產(chǎn)品對四種目標(biāo)微生物的殺滅效果。
作用時間-殺滅效果曲線：評估不同接觸時間下殺滅效果的變化，確定有效作用時間。
最低有效濃度測定：確定達(dá)到規(guī)定殺滅標(biāo)準(zhǔn)所需的最低產(chǎn)品濃度。
中和劑鑒定試驗：確保所選用的中和劑能及時、完全地終止待測產(chǎn)品的殺菌作用且自身無毒，保證后續(xù)培養(yǎng)計數(shù)的準(zhǔn)確性（尤其對于枯草桿菌芽孢）。

檢測儀器

試驗需使用的主要儀器設(shè)備如下：

生物安全柜（II級或以上）：提供無菌操作環(huán)境，保障實驗人員安全。
恒溫培養(yǎng)箱：用于細(xì)菌（通常35-37°C）和真菌（25-30°C）的培養(yǎng)。
恒溫水浴箱/金屬浴：精確控制試驗體系的溫度。
菌落計數(shù)器（手動或自動）：準(zhǔn)確計數(shù)平板菌落。
滅菌鍋：對培養(yǎng)基、器械及廢棄物進(jìn)行滅菌處理。
移液器及無菌吸頭：精確移取液體。
振蕩混合器：確保微生物懸液及反應(yīng)體系的均勻混合。
pH計：監(jiān)測反應(yīng)體系的pH值（某些消毒劑效果受pH影響顯著）。
恒溫?fù)u床/振蕩培養(yǎng)箱：用于微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)。

檢測方法

試驗通常采用以下兩種主要方法：

懸液定量殺菌試驗：
1. 制備高濃度、高純度的目標(biāo)微生物（細(xì)菌營養(yǎng)體、芽孢、酵母菌）懸液。
2. 將一定體積的微生物懸液加入到特定濃度的待測產(chǎn)品溶液中，于規(guī)定溫度下作用預(yù)定時間。
3. 立即加入經(jīng)鑒定合格的中和劑，充分混勻并作用足夠時間以終止殺菌反應(yīng)。
4. 進(jìn)行系列10倍稀釋。
5. 取適宜稀釋度的樣液接種至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板（如TSA用于細(xì)菌，SDA用于白色念珠菌）。
6. 恒溫培養(yǎng)規(guī)定時間（細(xì)菌通常24-48小時，白色念珠菌48-72小時，芽孢可能需更長時間）。
7. 計數(shù)存活菌落數(shù)（CFU），并與對照組（不含待測產(chǎn)品，用無菌水或PBS代替）的菌落數(shù)比較，計算殺滅對數(shù)值（Log Reduction）或殺滅率（%）。
載體定量殺菌試驗：適用于模擬實際表面消毒或評估產(chǎn)品在載體上的殺菌效果。
1. 將目標(biāo)微生物懸液定量滴加或涂布到無菌載體（如不銹鋼片、布片、玻片等）上，干燥。
2. 將載體浸入待測產(chǎn)品溶液或在其表面施加規(guī)定量的產(chǎn)品，作用預(yù)定時間。
3. 將載體移入含中和劑的無菌緩沖液中，洗脫或超聲震蕩洗下存活微生物。
4. 對洗脫液進(jìn)行系列稀釋和傾注平板培養(yǎng)。
5. 計數(shù)存活菌落，計算殺滅效果。

注意：枯草桿菌黑色變種芽孢試驗前需確保芽孢懸液的純度和含量，試驗后若無菌生長，常需進(jìn)行“復(fù)活培養(yǎng)”以確認(rèn)是否完全殺滅（如在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天）。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

本試驗需嚴(yán)格遵循國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性。主要參考標(biāo)準(zhǔn)包括：

國家標(biāo)準(zhǔn)（GB）：
- GB 15979-2002：一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（附錄中規(guī)定了相關(guān)微生物殺滅試驗方法）。
- GB/T 38502-2020：消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法。
- GB 27951-2020：皮膚消毒劑通用要求。
- GB 28232-2020：臭氧消毒器衛(wèi)生要求（涉及殺菌試驗）。
國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO）：
- ISO 20743:2021：紡織品 - 抗菌活性的測定。
- ISO 22196:2011：塑料及其他無孔表面抗菌活性的測量。
- ISO 11138-1:2017：醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 - 生物指示物 - 第1部分：通則（涉及芽孢抗力測試）。
- ISO 21527-1:2008 / -2:2008：食品和動物飼料的微生物學(xué) - 酵母菌和霉菌計數(shù)水平方法。
行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)/指南：
- 《消毒技術(shù)規(guī)范》（最新版，中華人民共和國衛(wèi)生部制定）。
- USP <1072>：消毒劑和防腐劑的效力測試。
- EN 1276：化學(xué)消毒劑和防腐劑 - 食品、工業(yè)、家用和機(jī)構(gòu)領(lǐng)域用消毒劑的定量懸浮液試驗 - 試驗方法和要求（第2階段/第1步）。

執(zhí)行試驗時，必須根據(jù)待測產(chǎn)品的預(yù)期用途（如醫(yī)療器械消毒、皮膚消毒、環(huán)境表面消毒、抗菌材料評價等）和注冊/備案要求，選擇最適用的標(biāo)準(zhǔn)和方法，并嚴(yán)格遵循其規(guī)定的實驗條件（如菌株來源、濃度、作用時間、溫度、干擾物質(zhì)、中和劑選擇、培養(yǎng)條件、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等）。對枯草桿菌黑色變種芽孢的殺滅效果，常是評價滅菌劑或高水平消毒劑的關(guān)鍵指標(biāo)。