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PEP內(nèi)源基因檢測

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發(fā)布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-07-24 22:19:56

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

PEP內(nèi)源基因檢測的概述

PEP（Primer Extension Preamplification）內(nèi)源基因檢測是一種基于分子生物學(xué)技術(shù)的高靈敏度檢測方法，主要用于內(nèi)源性參照基因的分析。這類檢測在基因表達研究、疾病診斷和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義，尤其適用于樣本量少或DNA/RNA質(zhì)量較低的場景。內(nèi)源基因檢測的核心目標(biāo)是驗證實驗體系中是否存在內(nèi)源污染或樣本交叉污染，同時評估樣本的完整性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性。

內(nèi)源性基因通常指生物體內(nèi)天然存在的保守性基因（如β-actin、GAPDH等），其表達水平在不同條件下相對穩(wěn)定，常被用作實驗的內(nèi)部控制。通過檢測這些基因的表達狀態(tài)，可有效排除外源干擾因素，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和個性化診斷需求的增長，PEP內(nèi)源基因檢測技術(shù)已成為分子診斷實驗室的核心質(zhì)控環(huán)節(jié)之一。

檢測項目

PEP內(nèi)源基因檢測的主要項目包括：
1. 內(nèi)源基因的表達穩(wěn)定性分析
2. 內(nèi)源基因拷貝數(shù)檢測
3. 樣本DNA/RNA的完整性評估
4. 實驗體系交叉污染篩查
5. 擴增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證

檢測儀器

需使用以下精密儀器：
- 實時熒光定量PCR儀（如ABI 7500、Roche LightCycler 480）
- 數(shù)字PCR系統(tǒng)（如Bio-Rad QX200）
- 高通量測序儀（Illumina NovaSeq）
- 核酸定量分析儀（Nanodrop、Qubit）
- 電泳成像系統(tǒng)（Bio-Rad GelDoc XR+）

檢測方法

主流檢測技術(shù)包括：
1. 實時熒光定量PCR（qPCR）
通過SYBR Green或TaqMan探針法，檢測內(nèi)源基因的Ct值，評估擴增效率及樣本質(zhì)量。需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品梯度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求擴增效率在90%-110%之間。

2. 數(shù)字PCR（dPCR）
將反應(yīng)體系分割為微滴單元進行絕對定量，可直接檢測內(nèi)源基因拷貝數(shù)，適用于低豐度樣本分析。

3. 基因測序技術(shù)
通過NGS或Sanger測序驗證內(nèi)源基因的序列特異性，排除非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。

4. 電泳分析
瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段大小，驗證目標(biāo)條帶是否符合預(yù)期。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

需遵循以下國際/國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：
- MIQE指南（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）
- ISO 20395:2019《生物技術(shù)—核酸定量方法的驗證要求》
- CLSI MM19-A2《分子診斷方法驗證標(biāo)準(zhǔn)》
- GB/T 34796-2017《核酸定量測量方法通則》
所有實驗需進行重復(fù)性（CV值≤5%）和靈敏度（檢測限≤10拷貝/μL）驗證，并納入陰性對照（NTC）和陽性對照體系。