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細(xì)胞增殖與活性檢測

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發(fā)布時(shí)間：2024-05-21 08:15:32 更新時(shí)間：2025-02-18 14:33:48

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　　細(xì)胞增殖與活性檢測去哪里做?中析研究所檢測中心可對各類細(xì)胞增殖與活性檢測，出具第三方細(xì)胞增殖與活性檢測報(bào)告。細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì)胞，用來補(bǔ)充體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞株均有增殖能力，為檢測研究的藥物或者基因的變化對細(xì)胞的增殖的影響，一般會(huì)使用MTT檢測、CCK8檢測、BrdU染色、EdU染色等實(shí)驗(yàn)。

檢測范圍

　　細(xì)胞凋亡分析、細(xì)胞周期和 DNA 修復(fù)、細(xì)胞活性與活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、粘附、趨化、胞吞和胞吐作用以及血管新生

MTT檢測

　　MTT 是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。適合貼壁細(xì)胞，不適合懸浮細(xì)胞檢測。

　　實(shí)驗(yàn)流程：

　　1.1、使用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)，接種3000-5000個(gè)細(xì)胞至96孔板，輕輕搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜;

　　1.2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行加藥或其他處理;

　　1.3、細(xì)胞培養(yǎng)到指定時(shí)間點(diǎn)后，加入10μl MTT溶液，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h;

　　1.4、去除培養(yǎng)基，加入DMSO溶液，輕輕搖晃將96孔板放入酶標(biāo)儀檢測。

CCK8檢測

　　Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物(formazan)。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深;細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞均可以進(jìn)行檢測。

　　實(shí)驗(yàn)流程：

　　2.1、使用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)，接種3000-5000個(gè)細(xì)胞至96孔板，輕輕搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜;

　　2.2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行加藥或其他處理;

　　2.3、細(xì)胞培養(yǎng)到指定時(shí)間點(diǎn)后，加入10μl CCK8溶液，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h;

　　2.4、將96孔板放入酶標(biāo)儀檢測。

BrdU染色檢測

　　BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶的衍生物，常用于標(biāo)記活性中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復(fù)制細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。隨著DNA復(fù)制可以可以進(jìn)入子細(xì)胞中，BrdU特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。

　　EdU和BrdU類似，另一種胸腺嘧啶核苷類似物。它也能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)檢測DNA復(fù)制活性，通過檢測EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作和BrdU類似。

　　實(shí)驗(yàn)流程：

　　3.1、接種5×105個(gè)細(xì)胞于玻璃底培養(yǎng)皿中，搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胨幬锘蚱渌幚怼?/p>

　　3.2、制備適量50μM BrdU培養(yǎng)基，37℃，孵育2h。除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次。

　　3.3、加入4%多聚甲醛常溫固定10min。

　　3.4、將多聚甲醛去除，加入預(yù)冷的PBS洗3次，每次5min。

　　3.5、加入含0.5% Triton X-100的PBS，在冰上將細(xì)胞膜穿刺10min。

　　3.6、去除PBS-Triton，加入預(yù)冷的PBS洗3次，每次5min。

　　3.7、加入PBS-3%BSA，常溫封閉30min。

　　3.8、將BrdU抗體按照1:100的比例稀釋在PBS-1%BSA溶液中，去除封閉液后，加入一抗，室溫孵育2h或者4℃孵育過夜。

　　3.9、去除一抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。

　　3.10、將熒光二抗分別按照1:400比例稀釋在PBS-1%BSA溶液中，去除PBS-T后，加入二抗，室溫避光孵育1h。

　　3.11、去除二抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。

　　3.12、加入100ng/mL DAPI溶液，室溫避光孵育10min。

　　3.13、去除DAPI，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。

　　3.14、加入防熒光淬滅溶液，4℃避光放置或直接在激光共聚焦顯微鏡拍照。

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

　　細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是檢測單個(gè)細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)方法。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，形成克隆，每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.2-1mm之間，集落的大小和數(shù)量反應(yīng)該細(xì)胞獨(dú)立生存能力和增殖能力，從而該實(shí)驗(yàn)反應(yīng)細(xì)胞增殖的情況。

　　實(shí)驗(yàn)流程：

　　4.1、接種500個(gè)細(xì)胞于六孔板中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

　　4.2、培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胨幬锘蚱渌幚?

　　4.3、每隔3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，去除培養(yǎng)基，加入PBS洗一次;

　　4.4、加入4%多聚甲醛或者乙醇固定10min，去除培養(yǎng)基，加入結(jié)晶紫染色液，常溫染色20min;

　　4.5、加入PBS洗3次，將六孔板放入烘箱中烘干，對克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)和拍照。