利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行基因敲除（knockout，KO），制備FOXI3敲除小鼠。小鼠的背景品系是C57BL/6。

(一)設(shè)計(jì)方案：

Foxi3 forkhead box I3 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 232077

Location: 6; 6 C1

Exon count: 2

（二）根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)，合成sgRNA

targeting site 1:

tcccaggtataagagacg   cgg

M-FOXI3-sgRNA-UP1           5’TAGGtcccaggtataagagacg

M-FOXI3-sgRNA-DOWN1       5’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA

targeting site 2:

atcgctcctcagacttga   tgg

M-FOXI3-sgRNA-UP2           5’TAGGatcgctcctcagacttga

M-FOXI3-sgRNA-DOWN2       5’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT

(三)顯微注射

1，超數(shù)排卵：15只3-4周齡C57雌鼠注射激素進(jìn)行超排。

2，受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。

3，雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的ICR雄鼠。

4，受體鼠制備：8-10周齡ICR與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

5，胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 150枚卵，5只受體鼠）。

(四)顯微注射基因型鑒定

1，剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。

2，基因組DNA提?。?使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3，PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測引物（上海英濰捷基）

M-FOXI3-ko-s   5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG   61.4℃

M-FOXI3-ko-a   5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC         62.3℃

M-FOXI3-wT-s    5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC   60.2℃

M-FOXI3-wT-A    5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG   60.8℃

M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃      KO  603bp 

M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃      WT  496bp

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序（TaKaRa RR042A）