|
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
8-10周齡SD雄性大鼠，用作種公鼠和結(jié)扎公鼠；4-6周齡雌性大鼠，用作超數(shù)排卵，8~10周齡雌性大鼠，用作受體。
主要試劑：
孕馬血清促性腺激素(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，M2培養(yǎng)液(M7167，Sigma)，M16培養(yǎng)液(M7292，Sigma)，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)，PCR試劑盒(Takara)，luciferaseSSA檢測(cè)試劑盒，瓊脂糖等
主要儀器：
低溫超速離心機(jī)，PCR儀，電泳儀，Leica體視鏡，顯微注射系統(tǒng)，超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)皿(BD Falcon)，一次性注射器，無(wú)菌手術(shù)器械(剪刀、鑷子、血管夾、持針器、手術(shù)縫線(xiàn)等)等
實(shí)驗(yàn)環(huán)境：
普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建與顯微注射。SD大鼠飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境。
實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：
- 供體與受體準(zhǔn)備
供體雌鼠超數(shù)排卵：選擇 4-6 周齡的雌鼠，于腹腔注射 PMSG 20 IU/只，48 h后注射hCG 20 IU/只，按1:1的比例與成年雄鼠合籠，于次日早上觀察雌鼠陰栓，見(jiàn)栓雌鼠取卵用于顯微注射。雄鼠結(jié)扎：選8-10周齡雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)麻醉后剪毛，75%酒精消毒，腹中線(xiàn)下方距陰莖2-3 cm處剪開(kāi)皮膚肌肉，分別分離出兩側(cè)輸精管，將鑷子在酒精燈上加熱后燒斷輸精管，關(guān)閉腹腔，待恢復(fù)2周后用于和雌鼠交配準(zhǔn)備受體。受體假孕鼠制備：于取卵前1 d選擇成年雌鼠與結(jié)扎雄鼠合籠，次日早上觀察雌鼠陰栓，見(jiàn)栓雌鼠即作為假孕鼠用作受精卵移植。
- TALEN 質(zhì)粒的準(zhǔn)備
TALEN設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)位置: exon2上，kinase 的domain 前5’-T GGACACACGACGTTGGC agggcttccgcctgga GGATTATCTGATAGGAC A-3’。將構(gòu)建的 TALEN質(zhì)粒對(duì)分別取 10 µg 酶切線(xiàn)性化，酚氯仿抽提、純化后取 1 µg 作模板，按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明依次加入 NTP/CAP、10×Buffer 及 Enzyme Mix，最后加水至20 µl轉(zhuǎn)錄體系，于37℃水浴2 h。轉(zhuǎn)錄后純化、鑒定，分裝保存于-80℃冰箱。
圖1. 組裝后的TALEN質(zhì)粒。
- 胚胎收集
將見(jiàn)栓雌鼠頸椎脫臼處死，75%酒精消毒后迅速剪開(kāi)腹腔，分離卵巢輸卵管和子宮，剪下輸卵管置于37℃預(yù)熱的M2液滴中，在體式鏡下將輸卵管膨大部劃開(kāi)，釋放出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞后，于M2培養(yǎng)液滴中洗3-5次后，移入覆蓋有礦物油的M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)以備顯微注射。
- 顯微注射
顯微鏡下觀察可見(jiàn)清晰原核的卵細(xì)胞為受精卵，挑選出用于顯微注射。將TALEN質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)錄的mRNA中放入注射針虹吸，注射針尖端充滿(mǎn)液體后安裝于注射儀上，根據(jù)注射針的出液量多少調(diào)節(jié)注射壓力，注射后可見(jiàn)胞質(zhì)有明顯膨脹表明成功注射入胞質(zhì)。將成功注射且存活的受精卵用于輸卵管移植。
- 輸卵管移植
將見(jiàn)栓的假孕鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg體重)，背部脊柱兩側(cè)肋骨下方剃毛，75%酒精消毒后依次剪開(kāi)皮膚肌肉，可見(jiàn)白色脂肪體，用鑷子夾住脂肪體向外牽拉出卵巢、輸卵管、子宮，在體視鏡下找到輸卵管膨大部，用血管夾夾住脂肪體以固定輸卵管在鏡下合適的位置，在輸卵管膨大部前方避開(kāi)血管走形剪開(kāi)一小口，將移卵管插入開(kāi)口吹入胚胎，液體后方吹入一氣泡防止液體反流。將脂肪體、卵巢、輸卵管及子宮還納入腹腔，縫合肌肉皮膚。
6. 出生大鼠鑒定 將受精卵移植的假孕鼠
單籠飼養(yǎng)22 d左右后觀察乳鼠出生情況。新生鼠生長(zhǎng)至 1 周以上即剪腳趾，消化液 55℃水浴消化過(guò)夜后，常規(guī)方法提基因組。對(duì)目的基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后送測(cè)序鑒定。
動(dòng)物倫理：
用于實(shí)驗(yàn)的SD大鼠購(gòu)自維通利華，飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境。飼養(yǎng)條件為溫度(24±2)℃，濕度為(50±10)%，光照周期為6:00~18:00，12 h晝夜交替。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的使用已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)（ICUC）批準(zhǔn)（QC18011）。 |
掃一掃，更多精彩