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1. 實(shí)驗(yàn)環(huán)境
生物安全實(shí)驗(yàn)室3級(jí)：參照2013年4月2日衛(wèi)計(jì)委專家對(duì)新發(fā)Zika病毒生物安全評(píng)估會(huì)議指南暫定Zika病毒屬于三類。將Zika動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。已被我國(guó)列為按甲類傳染病管理的乙類傳染病，對(duì)其病原體和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)的操作應(yīng)該在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
2. 實(shí)驗(yàn)材料
1）毒株：Zika毒株（ZKC2/2016）；
2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 8周齡雌性及雄性 BALB/c小鼠；
3）試劑：DMED培養(yǎng)液，RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74106）等
4）實(shí)驗(yàn)儀器：
微型離心機(jī)（EASTWIN6000）
高速冷凍離心機(jī)(KUBOTA3500)
電動(dòng)研磨器(德國(guó)IKA-T10)
倒置顯微鏡(Nikon)
實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)（ABI）
二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo371）
生物安全柜
3. 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程
3.1 動(dòng)物的飼養(yǎng)與繁育
1）倫理申請(qǐng)：按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求向北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物使用和倫理委員會(huì)提交實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用申請(qǐng)表。并獲得批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：ILAS-BLL17007）。
2）小鼠飼養(yǎng)：8周齡SPF級(jí)雌性及雄性BALB/c小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)獨(dú)立通風(fēng)屏障系統(tǒng)中，飼養(yǎng)房間溫度24-26℃，每天光照約14h。動(dòng)物自由飲水取食。大約每周換3次墊料。
3）BALB/c小鼠的繁育：每籠放8周齡SPF級(jí)雌性及雄性各一只，每日上午觀察雌鼠的陰道栓塞。見陰道栓塞后將雄性小鼠方另一單籠飼養(yǎng)備用。分籠后需給母鼠添加生長(zhǎng)繁殖飼料，大約18日后每日上午10點(diǎn)左右觀察懷孕母鼠的生育情況。規(guī)定每天觀察的生育的小鼠為0.5天；如有其他情況在10點(diǎn)以后觀察到小鼠妊娠或妊娠完成，記作第2天生育乳鼠。初生24-36h的乳鼠用于Zika病毒攻毒。
3.2 ZKC2/2016病毒的傳代
1）防護(hù)：涉及Zika病毒活病毒的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物置于具有HEPA過濾器的負(fù)壓分離器中，按照Zika病毒應(yīng)急生物安全手冊(cè)的要求在生物安全水平3（BSL-3）的動(dòng)物設(shè)施中進(jìn)行，并應(yīng)根據(jù)病原微生物的危害等級(jí)穿戴相應(yīng)的防護(hù)用品。
2）病毒接種：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制出血熱室饋贈(zèng)的ZKC2/2016，提前解凍至室溫，利用美國(guó)BD公司1ml胰島素注射器（針頭較細(xì)對(duì)動(dòng)物的損傷較?。┪?5ul病毒液，注射上述24-36h的乳鼠腦中縫處。注意插針、注射及取針動(dòng)作要輕柔以免對(duì)動(dòng)物造成過大的損失。整個(gè)過程盡量讓專人操作，操作人員受過專業(yè)培訓(xùn)并考核合格，保證每只乳鼠注射的位置、進(jìn)針深度大致相同。
3）動(dòng)物觀察：攻毒后輕輕地將乳鼠放回原處，攻毒后乳鼠可能會(huì)出現(xiàn)尿失禁的現(xiàn)象。攻毒后的乳鼠體溫會(huì)下降，注意保溫。第2天觀察乳鼠若出現(xiàn)死亡情況將乳鼠撿出，可能是死于機(jī)械損傷，凍存于-80℃冰箱以備統(tǒng)一高壓滅菌或直接高壓滅菌。
4）動(dòng)物解剖：每天觀察乳鼠情況，并于攻毒后第5天經(jīng)處死乳鼠。利用解剖剪刀和鑷子將鼠腦取出，放到提前在冰上提前預(yù)冷的2ml EP管中。
5）組織處理：將取出的感染Zika 病毒的鼠腦帶至生物安全2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步操作。傳第一代病毒命名為ZKC2P1,第二代為ZKC2P2，以此類推。
3.3 適應(yīng)株病毒鑒定
利用本研究設(shè)計(jì)的引物Zika 535和Zika 1211C，擴(kuò)增Zika 病毒核酸獲得包括引物探針的區(qū)域（835-911），PCR產(chǎn)物純化后連接pGEM-T Easy載體，利用pGEM-T上的T7啟動(dòng)子，使目的片段535-1211可以在體外轉(zhuǎn)錄。
3.4 ZKC2P6對(duì)乳鼠致病力
選取24-36h乳鼠9窩，調(diào)整每窩乳鼠數(shù)量為6只，隨機(jī)分為三組。ZKC2P6組、ZKC2P4及模擬感染組 (Mock) 分別腦內(nèi)注射25ul含1.5×107 copies ZKCP6病毒液、25ul含1.5×107 copies ZKCP4病毒液及年齡匹配的空白鼠腦研磨上清液。攻毒后1dpi、3dpi、5dpi及7dpi稱量每只乳鼠的體重并記錄死亡情況。每組隨機(jī)選取另外3窩乳鼠，攻毒后1dpi、3dpi、5dpi及7dpi每天取三只乳鼠腦并稱量重量、測(cè)量長(zhǎng)、寬。本研究利用Zika病毒感染初生乳鼠后觀察小鼠大腦皮層及腦室的變化。將上述稱量腦重的鼠腦固定后進(jìn)行HE染色。ZKC2P4與ZKC2P6分別腦內(nèi)感染一窩乳鼠（每窩6只），第3天和第5天分別取3只鼠腦并稱重，按照病毒RNA提取操作流程提取RNA。 |
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