C57BL/6小鼠

一、模型設(shè)計(jì)原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實(shí)現(xiàn)CCKBR基因條件性敲除的目的。實(shí)驗(yàn)采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

根據(jù)CCKBR基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)分析在Exon1的兩邊定點(diǎn)插入FloxP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)將Exon1條件性敲除。

二、模型設(shè)計(jì)過程：

1)CCKBR基因GRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及活性檢測

在要?jiǎng)h除的Exon1外顯子兩端，設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)如下：

Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG

Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG

Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG

Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG

Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG

Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC

Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG

Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC

Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG

Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA

Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG

Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA

使用Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測試劑盒（貨號：VK007）進(jìn)行g(shù)RNA體外活性檢測，結(jié)果如下：

gRNA靶點(diǎn)活性檢測結(jié)果分析如下：

2）CCKBR^flox/flox,villin Cre小鼠設(shè)計(jì)

3）CCKBR^flox/flox,villin Cre小鼠模型的繁育及鑒定結(jié)果：

CCKBR^floxp/flox小鼠與Cre 的小鼠（villin Cre）雜交，對后代自交獲得的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功獲得CCKBR腸道上皮細(xì)胞條件性基因敲除小鼠CCKBR^flox/flox,villin Cre）。見下圖

經(jīng)鑒定12#: CCKBR^flox/flox,villin Cre

CCKBR^fl/fl; Villin Cre小鼠結(jié)果分析