C57BL/6J小鼠

基因敲除構建設計。

條件性Ddit-4基因敲除小鼠采用PCR方式進行基因敲除的鑒定。

表4. 鑒定引物序列

1）F1+R1 引物PCR 檢測L 端floxp 插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：235 bp 帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：235bp，一條為WT：201 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：201bp 帶

2）F2+R2 引物PCR 檢測R 端floxp 插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：177bp 帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：177 bp，一條為WT：143 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：143 bp 帶

3）F+R 引物PCR 檢測兩端floxp 插入情況：

需要測序判斷，測序引物為F(或R1)和F(或F2)

①純合子（f/f）：測序峰型為單峰，比對與Donor 序列一致，插入兩個floxp 序列

②雜合子（f/w）：測序峰型為雙峰，能讀出含有floxp 序列的套峰

③野生型（wt）：測序峰型為單峰，比對與野生型序列一致

測序結果：將F/R 引物擴增的PCR 產(chǎn)物測序確認5#小鼠為兩端精確插入floxp 序列的雜合子，具體見圖3。黑色箭頭代表野生型序列，紅色箭頭代表插入的序列，L 端和R 端測序的峰形分析，都可確認在小鼠floxp 序列（ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT）精確插入指定位置。

L 端flxop 插入分析（測序引物：R1）