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條件性Enpp1Floxp敲除小鼠模型

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發(fā)布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-11-04 08:54:38

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

資源中文名稱

條件性Enpp1-Floxp敲除小鼠模型

資源英文名稱

Enpp1-Floxp conditional knockout mouse model

疾病概述

低磷性佝僂病（Hypophosphatemicriskers）是兒童常見的代謝性骨病，是由于各種原因引起腎小管對磷的重吸收障礙，從而導(dǎo)致骨發(fā)育不良的一組腎失磷性代謝性骨病，臨床表現(xiàn)為低磷血癥、身材矮小、雙下肢骨骼畸形。兒童期的低磷性佝僂病多為遺傳性，包括常染色體顯性遺傳（ADHR）、常染色體隱性遺傳（ARHR）、X連鎖遺傳（XLHR）、伴高鈣尿癥的遺傳性低磷性佝僂病（HHRH）等。Enpp1基因是已確定的可導(dǎo)致低磷性佝僂病的基因之一，屬于常染色體隱性遺傳。嬰兒全身動脈鈣化(Generalized Arterial Calcification of Infancy，GACI)是少見的疾病，其特點是伴不規(guī)則內(nèi)膜增厚的彌漫性動脈鈣化，冠狀動脈受累，通常在9個月前死亡。Enpp1基因也被證實與GACI有關(guān)。它編碼的蛋白是一種II型跨膜糖蛋白，屬于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早發(fā)現(xiàn)于漿細(xì)胞（PC）中；在許多非淋巴組織中表達(dá)，包括軟骨、心臟、腎臟、肝臟和唾液腺，并在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)；參與多種生物學(xué)途徑。首先，ENPP1蛋白具有廣泛的底物特異性，包括ATP、UTP、cAMP和2'3'-cGAMP。該酶催化5' -磷酸二酯酶鍵，主要在ATP中，生成核苷5'-單磷酸和無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)，后者是骨形成過程中礦物結(jié)晶的抑制劑。對于Enpp1基因進(jìn)行失活突變或基因沉默的小鼠，由于關(guān)節(jié)和椎旁韌帶過度鈣化，表現(xiàn)出“關(guān)節(jié)僵硬”和“踮腳走路”的表型。Enpp1突變也會導(dǎo)致小鼠和人類的血管鈣化，導(dǎo)致人類常染色體隱性低磷血癥性佝僂病(ARHR)或嬰兒期廣義動脈鈣化(GACI)。其次，ENPP1通過將ATP分解為AMP來介導(dǎo)核苷酸循環(huán)，而AMP再被5'核苷酸酶轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷則被自由地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中進(jìn)行新陳代謝。ATP和腺苷都具有免疫調(diào)節(jié)功能。第三，ENPP1參與脂肪細(xì)胞分化，并在碳水化合物代謝和胰島素抵抗中發(fā)揮作用；ENPP1與胰島素受體結(jié)合，抑制下游信號通路，從而誘導(dǎo)胰島素抵抗和葡萄糖耐受。第四，ENPP1對于正常B細(xì)胞的發(fā)育是必不可少的，而且對于長壽漿細(xì)胞（LLPC）的發(fā)育和生存更是至關(guān)重要。Enpp1突變模型也應(yīng)用于衰老研究。

實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠

模型制作方法

基因敲除構(gòu)建設(shè)計

模型表型數(shù)據(jù)

條件性Enpp1-Floxp敲除小鼠雜合子采用PCR方式進(jìn)行基因敲除的鑒定。

（1）引物信息：見表1

表4. 鑒定引物序列

引物設(shè)計	引物名稱	引物序列（5’-3’）	PCR產(chǎn)物大小
跑膠檢測L端floxp插入情況	F1	CTGGAGTTGAGGCTCAGGTG	KI：225 bp WT：191 bp
跑膠檢測L端floxp插入情況	R1	TGGAACCCAAGCTGGCATC	KI：225 bp WT：191 bp
跑膠檢測R端floxp插入情況	F2	TGTACCCTACCAAGACGTTTCC	KI：236 bp WT：202 bp
跑膠檢測R端floxp插入情況	R2	TTCCGGATAAAGTCCCTAAGG	KI：236 bp WT：202 bp
測序檢測兩端floxp插入情況	F	ACAGCTGACTCCTCCGTTCC	KI：1196 bp WT：1128 bp
測序檢測兩端floxp插入情況	R	GTTTGCCGAAATTCCTACGG	KI：1196 bp WT：1128 bp

引物不同組合檢測分析：

F1+R1引物PCR檢測L端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：225 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：225 bp，一條為WT：191 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：225 bp帶

F2+R2引物PCR檢測R端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：236 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：236 bp，一條為WT：202 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：202 bp帶

F+R引物PCR檢測兩端floxp插入情況：

需要測序判斷，測序引物為F(或R1)和F(或F2)

①純合子（f/f）：測序峰型為單峰，比對與Donor序列一致，插入兩個floxp序列

②雜合子（f/w）：測序峰型為雙峰，能讀出含有floxp序列的套峰

③野生型（wt）：測序峰型為單峰，比對與野生型序列一致

測序結(jié)果：將F/R 引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物測序確認(rèn)該小鼠為均為兩端精確插入floxp列的雜合子，具體見圖3。黑色箭頭代表野生型序列，紅色箭頭代表插入的序列，L端和R端測序的峰形分析，都可確認(rèn)該小鼠floxp序列（ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT）精確插入指定位置。說明條件性Enpp1-floxp敲除小鼠構(gòu)建成功。

L端floxp插入分析（測序引物：F）

R端flxop插入分析（測序引物：R）