細(xì)胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT） 5 是幾乎所有腸道細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)激素下游轉(zhuǎn)錄活化因子 。去除或減少 STAT5 能夠?qū)е屡咛ジ杉?xì)胞，造血干細(xì)胞，肝干細(xì)胞，髓樣干細(xì)胞，以及乳腺干細(xì)胞分化異常和組織功能障礙 。

我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了敲除腸上皮 STAT5 導(dǎo)致 Lgr5+ IESC 再生障礙，上皮屏障缺失，增加腸炎易感性 。相反， 短暫的 STAT5 酪氨酸磷酸化（pYSTAT5） 能夠增加Lgr5+腸干細(xì)胞再生，保護(hù)腸道，減輕實(shí)驗(yàn)性腸炎。 但是， STAT5 是否能夠調(diào)節(jié) IESC 內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄、激活因子，調(diào)節(jié)何種上游細(xì)胞因子以及誘導(dǎo)何種腸上皮分化，還未見報(bào)道。因此我們使用特定的 Stat5 復(fù)合基因工程小鼠與Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，進(jìn)行腸上皮細(xì)胞分化的譜系追蹤來確定持續(xù)性的 pYSTAT5 激活能夠誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞分化為何種細(xì)胞類型。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

試劑：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機(jī)，leica DMI8活細(xì)胞工作站

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：將Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系與Stat5 或 icS5 floxed小鼠雜交，分別為對(duì)照組（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；實(shí)驗(yàn)1組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；實(shí)驗(yàn)2組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周齡時(shí)，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測(cè)小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR條件：預(yù)變性94℃3min；94℃變性30s，66℃復(fù)性1min，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。選取雙陽(yáng)性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。實(shí)驗(yàn)組小鼠按100mg/kg體重腹腔注射他莫昔芬，對(duì)照組小鼠注射等量的玉米油。通過 Tam 誘導(dǎo)， 然后分別在 12 小時(shí)和 1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉處死各組小鼠。分別取結(jié)腸、空腸、回腸組織，用冷PBS沖洗腸道組織，縱向剖開，放入多聚甲醛中固定過夜，制作冰凍切片在子代腸上皮細(xì)胞中追蹤檢測(cè)是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能夠改變腸上皮中的tdToamto 信號(hào)強(qiáng)度和位置.

1、 基因鑒定信息

圖1  Lgr5, Rosa26tdTomato基因凝膠電泳鑒定結(jié)果